Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר New Frontiers in Research (NFRFE201901326), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (162211, 461274, 461275), הקרן הקנדית לחדשנות (37439), תוכנית קתדרה למחקר בקנדה (950-231859), המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2019-06824), ו- Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מונטריאול (#22053, #22054) אישרו את כל ההליכים לבעלי חיים. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם וטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי</str...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies et al.11 מצאו שתאי עצב פצועים מווסתים את RAE1. באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הצליחו לזהות ולחסל נוירונים RAE1+ , אשר בתורם מגבילים כאב כרוני11. בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים גם קולטני נוירופפטידים שונים, וכי נוירופפטידים אלה ידועים ביכולותיהם האימונומוד?...

גופי התאים של נוירונים חושיים מקורם בגרעיני השורש הגבי (DRG). ה- DRG ממוקמים במערכת העצבים ההיקפית (PNS), בין הקרן הגבית של חוט השדרה לבין קצות העצבים ההיקפיים. האופי הפסאודו-חד קוטבי של נוירוני DRG מאפשר העברת מידע מהענף ההיקפי, אשר innervates את רקמת המטרה, אל הענף המרכזי, אשר נושא את המידע הסומטוסנסורי אל חוט השדרה1. באמצעות קולטני תעלות יונים מיוחדים, נוירונים מסדר ראשון חשים איומים הנשקפים מפתוגנים, אלרגנים ומזהמים2, מה שמוביל לזרם הקטיונים (Na+, Ca2+) וליצירת פוטנציאל פעולה 3,4,5.
תאי עצב אלה גם שולחים פוטנציאל פעולה אנטי-דרומי לכיוון הפריפריה, שם התרחשה חישת הסכנה הראשונית, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים 1,4. לכן, נוירונים nociceptor לשמש מנגנון הגנה, התראה המארח על סכנה סביבתית 4,5,6,7.
כדי לתקשר עם נוירונים מסדר שני, הנוציצפטורים משחררים מוליכים עצביים שונים (למשל, גלוטמט) ונוירופפטידים (למשל, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP), חומר P (SP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP))6,7. פפטידים אלה פועלים על נימים ומקדמים אקסטרווזיה של פלזמה, בצקת, ואת הזרימה והמודולציה המקומית של תאי מערכת החיסון 2,4,7.
המערכת הסומטוסנסורית ומערכת החיסון משתמשות במערכת תקשורת משותפת המורכבת מציטוקינים ונוירופפטידים, והקולטנים הקוגנטיים שלהם4. בעוד שתקשורת דו-כיוונית זו מסייעת בהגנה מפני סכנה ובשימור הומאוסטזיס, היא יכולה גם לתרום לפתופיזיולוגיה של מחלות4.
תאי NK מסווגים כתאי לימפה מולדים והם מתמחים בחיסול תאים נגועים ויראליים. תפקוד תאי NK נשלט על ידי איזון של קולטנים מגרים ומעכבים, כולל הקולטן המפעיל NKG2D8. הליגנד האנדוגני של NKG2D, חומצה רטינואית מוקדמת1 (RAE1), מתבטא בתאים העוברים עקה כגון גידולים וזיהום 8,9.
מחקרים אחרונים הראו כי פגיעה עצבית היקפית מניעה נוירונים תחושתיים לבטא מולקולות לא מסתגלות כגון stathmin 2 (STMN2) ו- RAE1. כך, באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הופעלו על ידי אינטראקציה עם נוירונים המבטאים RAE1. בתורו, תאי NK היו מסוגלים לחסל נוירונים nociceptor פצוע קהה רגישות יתר כאב קשורה בדרך כלל עם פגיעה עצבית10. בנוסף לציר NKG2D-RAE1, תאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor. לכן ייתכן שהמתווכים האלה מווסתים את פעילות תאי ה-NK. מאמר זה מציג שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את הביולוגיה של האינטראקציה בין תאי הנוירון-NK של nociceptor. גישה זו תסייע לקדם את ההבנה כיצד נוירונים של nociceptor מווסתים תגובות של תאי חיסון מולדים לפציעה, זיהום או ממאירות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

נוירונים סומטוסנסוריים התפתחו כדי לזהות גירויים רעילים ולהפעיל רפלקסים הגנתיים. על ידי שיתוף אמצעי תקשורת, נוירונים nociceptor גם לכוון את הגנות המארח על ידי שליטה על הפעילות של המערכת החיסונית. התקשורת בין מערכות אלה היא בעיקר אדפטיבית, עוזר להגן על הומאוסטזיס, זה יכול גם להוביל, או לקדם, את הופעת מחלות כרוניות. שתי המערכות התפתחו יחד כדי לאפשר אינטראקציה מקומית כזו, כפי שנמצאת ברקמות לימפה ראשוניות ומשניות וברירית. מחקרים אחרונים הראו כי nociceptors מזהים ומגיבים ישירות לאנטיגנים זרים, ציטוקינים שמקורם בתאי מערכת החיסון ומיקרובים.
הפעלת Nociceptor לא רק גורמת לרגישות יתר לכאב וגירוד, אלא מורידה את סף ירי הנוציצפטור, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים. הפפטידים המיוצרים על ידי, ומשוחררים, הטרמינלים ההיקפיים של nociceptors יכול לחסום את chemotaxis ואת הקיטוב של לימפוציטים, שליטה על לוקליזציה, משך, וסוג של דלקת. עדויות עדכניות מראות כי נוירונים תחושתיים מתקשרים עם תאי חיסון מולדים באמצעות מגע בין תאים, לדוגמה, תוך הפעלת קולטני דו-ממד מקבוצה (NKG2D) על תאי הרג טבעי (NK).
בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor, ניתן להעלות על הדעת כי nociceptors להשתמש נוירופפטידים כדי לשלוט על הפעילות של תאי NK. כאן, אנו מפתחים שיטת תרבית משותפת כדי לחקור אינטראקציות נוירון-NK של nociceptor בצלחת. באמצעות גישה זו, מצאנו כי נוירונים של nociceptor מותני מפחיתים את ביטוי הציטוקינים של תאי NK. באופן כללי, שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירונים מעוררי גידול שולטים בתפקוד האנטי-סרטני של תאי NK, וכיצד תאי NK שולטים בחיסול תאי עצב פצועים.

תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TAfl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). לאחר מכן נ...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

נוירונים Nociceptor ותאי NK אינטראקציה פעילה בהקשר דלקתי. גישה של תרבות משותפת מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין האלה.

נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

בהתחשב בכך שנוירון הנוציצפטור מפריש נוירופפטידים שונים ושתא NK ביטא את הקולטן לנוירופפטידים אלה, החלטנו להמציא שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תא ה-NK לבין תאי הנוירונים של הנוציצפטור. שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירון nociceptor לשלוט על תפקוד אנטי סרטני של תא NK, וזה יכול להיות גם מעניין לחקור כיצד תא NK שולט על חיסול של נוירונים פצועים. מי שידגים את ההליך יהיה עלי אחמדי, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי.כדי להתחיל את ההרג הטבעי או בידוד תאים NK ותרביה, לאסוף את הטחול העכבר בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של PBS סטרילי, ולאחר מכן הומוגניות הטחול באמצעות מזיק. לאחר מכן, לדלל את התאים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי ולסנן את התערובת דרך מסננת תאים של 50 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. טען את נפח ההומוג'נט המסונן ל-10 מיליליטר באמצעות PBS סטרילי.לספור את התאים ב 10 microliters של הומוגנט מדולל באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה של התאים הנותרים במשך חמש דקות ב 500 G ולהסיר את supernatant. לאחר מכן יש להשעות את התאים ב-10 עד 8 תאים למיליליטר בתוספת RPMI 1640 בינונית.לטהר באופן מגנטי את תאי הטחול NK באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר ולאשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה. סופרים את התאים באמצעות המוציטומטר, ואחריו צנטריפוגה בחמש דקות ב-500 גרם, ואז מסירים את הסופר-נאטנט. כדי לעורר את תאי ה-NK הכדוריים, יש להשעות את התאים הללו בתרבית RPMI 1640 בתוספת IL-2 ו-IL-15.תרבית פעמיים 10 עד השישית תאי NK למיליליטר בצלחת U-bottom של 96 באר במשך 48 שעות. 24 שעות לפני גירוי תאי NK, מצפים את צלחת 96 הבאר עם 100 מיקרוליטר לכל באר של למינין ודגירה אותו במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון הבטיחות הביולוגית.לאחר מכן, אבטח את העכבר המומת על הלוח במצב נוטה. הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.לאחר מכן להפריד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני הצדדים בכיוון הגולגולת עד בסיס הגולגולת הוא הגיע. השתמש מספריים כדי לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlantooccipital. לאחר מכן, להסיר את השריר ואת רקמת השומן מן עמוד השדרה.הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה לפני קבלת גישה לשורש הגבי גנגליון או DRG בפורמינה הבין חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי. לאחר מכן, קצרו את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של DMEM קר כקרח. לאחר מכן צנטריפוגה את ההכנה במשך חמש דקות ב 200 G בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.הוסף 250 מיקרוליטרים של PBS המכילים מיליגרם אחד למיליליטר קולגן IV ו -2.4 יחידות למיליליטר dispase II.דגירה של DRG זה עם תמיסת קולגן-דיספאז במשך 80 דקות עם תסיסה קלה. כדי להשבית את האנזימים, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תוסף DMEM בינוני וצנטריפוגה של התמיסה ב-200 גרם.לאחר חמש דקות, הסירו בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשאירו כ-100 מיקרוליטרים של הסופר-נאטנט כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי. לאחר מכן, הוסיפו מדיום DMEM של מיליליטר אחד לתאים והשתמשו באקדח פיפטה ובשלושה פיפטות פסטר מזכוכית בגדלים הולכים ופוחתים כדי להפוך בעדינות את ה-DRG להכנת תא אחד.תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר או BSA ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15% ולאחסן אליקוט מיליליטר אחד במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי ליצור שיפוע BSA בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, הוסף שני מיליליטר של PBS סטרילי ולאחר מכן החלק באיטיות מיליליטר אחד של תמיסה של 15% BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.באמצעות פיפטה P200, הוסף את תרחיף הגרעינים המשולש המכיל את הנוירונים על צד הצינור לתוך השיפוע. לאחר מכן הגדר את ההאצה וההאטה למינימום כדי לצנטריפוגה של הנוירון המכיל את שיפוע BSA למשך 12 דקות ב 200 G.לאחר הצנטריפוגה, הסר את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשעה את התאים ב -500 מיקרוליטרים של Neurobasal. צלחת 10, 000 נוירונים לכל באר בצלחת תחתית שטוחה מצופה למינין 96 באר.כדי לאפשר את ההתקשרות של הנוירונים, לדגור את צלחת 96 באר לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהתרבות משותפת, הסר באיטיות את הנוירובסל מתרבית הנוירונים. לאחר 48 שעות של גירוי עם IL-2 ו- IL-15, השהה את תאי ה- NK והוסף 10 לתאי ה- NK החמישי לכל באר לתרבית הנוירונים.תרבית משותפת של התאים בתוספת Neurobasal MX בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS וצנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 500 G בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant לפני מכתים את התאים עם אחד עד 1, 000 מדולל כדאיות צבע eFluor 780 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לשטוף ולעשות צנטריפוגה של התאים כפי שהוכח, ולאחר מכן לטפל עם CD 1632 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום אתרים לא ספציפיים על התאים, ולאחר מכן לאסוף ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר המחזור הבא של שטיפה וצנטריפוגה, הכתימו את התאים ב-BV421, אנטי-NK-1.1, פלואורסצין איזותיוציאנט אנטי-NKp46, ופיקואריתרין אנטי-GM-CSF למשך 15 דקות. שוב, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, צנטריפוגה אותם ולהשליך את supernatant, ולאחר מכן להשעות את התאים ב 500 microliters של חיץ FACS ואימונופנוטיפ תאי NK באמצעות ציטומטריה זרימה.כאשר תרבית לבדה, תאי NK ביטאו רמות בסיסיות של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים מקרופאגים או GM-CSF ו- NKp46. כאשר תרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים שלמים של nociceptor, גירוי קפסאיצין הפחית את הביטוי של תאי NK של GM-CSF. לקפסאיצין לא הייתה השפעה על פעילות תאי NK כאשר הוא תרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים אבלטים של nociceptor.הרמה של NKp46 לא הושפעה. השלבים המרכזיים בפרוטוקול זה הם הדיסוציאציה והבידוד של DRG. הרעיון הוא לשמור על כדאיות עצבית מקסימלית על ידי הימנעות מיצירת בועות ושימוש בפיפטה בגודל הנכון.לאחר הפרוטוקול, החוקרים יכולים להשתמש בריצוף RNA או qPCR כדי למדוד שינוי תעתיק בתאים מטוהרים של FACS, או שהם יכולים להשתמש ב- ELISA כדי למדוד את הפרשת הציטוקינים או הנוירופפטידים. יחסי גומלין כאלה מגלים כי תפקוד תאי NK ככל הנראה מכוון על ידי נוירון nociceptor. וההצלבה הזו עשויה להיות חשובה בתהליכים ביולוגיים המשתרעים מפגיעה עצבית, זיהום חיידקי וויראלי, ועד ממאירויות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...