Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

इस काम को द न्यू फ्रंटियर्स इन रिसर्च फंड (एनएफआरएफई 201901326), कैनेडियन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (162211, 461274, 461275), कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन (37439), कनाडा रिसर्च चेयर प्रोग्राम (950-231859), नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (आरजीपीआईएन-2019-06824) और फोंड्स डी रेचेरचे डु क्यूबेक नेचर एट टेक्नोलॉजीज (2533) द्वारा समर्थित किया गया था।

Université de Montreal (# 22053, # 22054) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों ने सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। समाधानों और उनकी संरचना की सूची के लिए तालिका 1 और इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री</strong...

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	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

डेविस एट अल .11 ने पाया कि घायल न्यूरॉन्स आरएई 1 को विनियमित करते हैं। सेल-सेल संपर्क के माध्यम से , एनकेजी 2 डी-व्यक्त एनके कोशिकाएं तब आरएई 1 + न्यूरॉन्स की पहचान करने और खत्म करने में सक्षम ?...

संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकाय पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) में उत्पन्न होते हैं। डीआरजी परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) में स्थित होते हैं, रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग और परिधीय तंत्रिका टर्मिनलों के बीच। डीआरजी न्यूरॉन्स की छद्म-एकध्रुवीय प्रकृति परिधीय शाखा से सूचना के हस्तांतरण की अनुमति देती है, जो लक्ष्य ऊतक को केंद्रीय शाखा में आंतरिक करती है, जो रीढ़ की हड्डी1 में सोमाटोसेंसरी जानकारी ले जाती है। विशेष आयन चैनल रिसेप्टर्स का उपयोग करके, प्रथम-क्रम न्यूरॉन्स रोगजनकों, एलर्जी और प्रदूषक2 द्वारा उत्पन्न खतरों को महसूस करते हैं, जिससे पिंजरों (Na+, Ca2+) की आमद होती है और एक क्रिया क्षमता 3,4,5 उत्पन्न होती है।
ये न्यूरॉन्स परिधि की ओर एंटीड्रोमिक एक्शन क्षमता भी भेजते हैं, जहां प्रारंभिक खतरे की संवेदन हुआ था, जो न्यूरोपैप्टाइड्स 1,4 की स्थानीय रिहाई की ओर जाता है। इसलिए, नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स एक सुरक्षात्मक तंत्र के रूप में काम करते हैं, मेजबान को पर्यावरणीय खतरे 4,5,6,7 के प्रति सचेत करते हैं।
दूसरे क्रम के न्यूरॉन्स के साथ संवाद करने के लिए, नोसिसेप्टर विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर (जैसे, ग्लूटामेट) और न्यूरोपैप्टाइड्स (जैसे, कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी), पदार्थ पी (एसपी), और वासोएक्टिव आंतों पेप्टाइड (वीआईपी)) 6,7 जारी करते हैं। ये पेप्टाइड्स केशिकाओं पर कार्य करते हैं और प्लाज्मा एक्स्ट्रावेसन, एडिमा और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीय प्रवाह और मॉड्यूलेशनको बढ़ावा देते हैं 2,4,7.
सोमाटोसेंसरी और प्रतिरक्षा प्रणाली साइटोकिन्स और न्यूरोपैप्टाइड्स से बनी एक साझा संचार प्रणाली का उपयोग करती है, और उनके संबंधित आत्मीय रिसेप्टर्स4. जबकि यह द्विदिश संचार खतरे से बचाने और होमियोस्टैसिस को संरक्षित करने में मदद करता है, यह रोग पैथोफिज़ियोलॉजी4 में भी योगदान कर सकता है।
एनके कोशिकाओं को जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और वायरल संक्रमित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए विशिष्ट होते हैं। एनके सेल फ़ंक्शन उत्तेजक और निरोधात्मक रिसेप्टर्स के संतुलन द्वारा नियंत्रित होता है, जिसमें सक्रिय रिसेप्टर एनकेजी 2 डी 8 शामिलहै। एनकेजी 2 डी का अंतर्जात लिगैंड, रेटिनोइक एसिड अर्ली इंड्यूसेबल 1 (आरएई 1), ट्यूमरजेनिसिस और संक्रमण 8,9 जैसे तनाव से गुजरने वाली कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है।
हाल की जांच से पता चला है कि परिधीय तंत्रिका चोट संवेदी न्यूरॉन्स को स्टैथमिन 2 (एसटीएमएन 2) और आरएई 1 जैसे दुर्भावनापूर्ण अणुओं को व्यक्त करने के लिए प्रेरित करती है। इस प्रकार, सेल-सेल संपर्क के माध्यम से , एनकेजी 2 डी-व्यक्त एनके कोशिकाओं को आरएई 1-व्यक्त न्यूरॉन्स के साथ बातचीत द्वारा सक्रिय किया गया था। बदले में, एनके कोशिकाएं घायल नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स को खत्म करने और दर्द अतिसंवेदनशीलता को कुंद करने में सक्षम थीं जो सामान्य रूप से तंत्रिका चोट10 से जुड़ी होती हैं। एनकेजी 2 डी-आरएई 1 अक्ष के अलावा, एनके कोशिकाएं विभिन्न नोसिसेप्टर-उत्पादित मध्यस्थों के लिए आत्मीय रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं। इसलिए यह संभव है कि ये मध्यस्थ एनके सेल गतिविधि को संशोधित करें। यह पेपर नोसिसेप्टर न्यूरॉन-एनके सेल इंटरैक्शन के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण इस बात को समझने में मदद करेगा कि नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स चोट, संक्रमण या घातकता के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं को कैसे नियंत्रित करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स हानिकारक उत्तेजनाओं का पता लगाने और रक्षात्मक सजगता को सक्रिय करने के लिए विकसित हुए हैं। संचार के माध्यमों को साझा करके, नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स प्रतिरक्षा प्रणाली की गतिविधि को नियंत्रित करके मेजबान सुरक्षा को भी ट्यून करते हैं। इन प्रणालियों के बीच संचार ज्यादातर अनुकूली है, जो होमियोस्टैसिस की रक्षा करने में मदद करता है, यह पुरानी बीमारियों की शुरुआत को भी जन्म दे सकता है, या बढ़ावा दे सकता है। दोनों प्रणालियां इस तरह की स्थानीय बातचीत की अनुमति देने के लिए सह-विकसित हुईं, जैसा कि प्राथमिक और माध्यमिक लिम्फोइड ऊतकों और म्यूकोसा में पाया जाता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि नोसिसेप्टर सीधे विदेशी एंटीजन, प्रतिरक्षा कोशिका-व्युत्पन्न साइटोकिन्स और रोगाणुओं का पता लगाते हैं और प्रतिक्रिया करते हैं।
नोसिसेप्टर सक्रियण के परिणामस्वरूप न केवल दर्द अतिसंवेदनशीलता और खुजली होती है, बल्कि नोसिसेप्टर फायरिंग सीमा कम हो जाती है, जिससे न्यूरोपैप्टाइड्स की स्थानीय रिहाई होती है। पेप्टाइड्स जो नोसिसेप्टर्स के परिधीय टर्मिनलों द्वारा उत्पादित और जारी किए जाते हैं, केमोटैक्सिस और लिम्फोसाइटों के ध्रुवीकरण को अवरुद्ध कर सकते हैं, स्थानीयकरण, अवधि और सूजन के प्रकार को नियंत्रित कर सकते हैं। हाल के सबूत ों से पता चलता है कि संवेदी न्यूरॉन्स सेल-सेल संपर्क के माध्यम से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं, उदाहरण के लिए, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं पर समूह 2 डी (एनके 2 डी) रिसेप्टर्स को संलग्न करना।
यह देखते हुए कि एनके कोशिकाएं विभिन्न नोसिसेप्टर-उत्पादित मध्यस्थों के लिए आत्मीय रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं, यह संभव है कि नोसिसेप्टर एनके कोशिकाओं की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए न्यूरोपैप्टाइड्स का उपयोग करते हैं। यहां, हम एक डिश में नोसिसेप्टर न्यूरॉन-एनके सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि तैयार करते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि काठ नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स एनके सेल साइटोकिन अभिव्यक्ति को कम करते हैं। कुल मिलाकर, इस तरह की एक कमीवादी विधि यह अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है कि ट्यूमर-इनरवेटिंग न्यूरॉन्स एनके कोशिकाओं के एंटीकैंसर फ़ंक्शन को कैसे नियंत्रित करते हैं और एनके कोशिकाएं घायल न्यूरॉन्स के उन्मूलन को कैसे नियंत्रित करती हैं।

एनके कोशिकाओं को लिटरमेट कंट्रोल (टीआरपीवी 1डब्ल्यूटी: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) चूहों स्प्लेनोसाइट्स से चुंबकीय रूप से शुद्ध किया गया और आईएल -2 और आईएल -15 के साथ उत्तेजित (48 घंटे) किया गया। एनके कोशि?...

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Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स और एनके कोशिकाएं सक्रिय रूप से एक भड़काऊ संदर्भ में बातचीत करती हैं। एक सह-संस्कृति दृष्टिकोण इस अंतःक्रिया का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।

प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया को छेड़ना

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

यह देखते हुए कि नोसिसेप्टर न्यूरॉन विभिन्न न्यूरोपैप्टाइड का स्राव करता है और एनके सेल ने इन न्यूरोपैप्टाइड के लिए रिसेप्टर व्यक्त किया, हमने एनके सेल और नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि तैयार करने का फैसला किया। इस तरह की एक कमीवादी विधि यह अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है कि नोसिसेप्टर न्यूरॉन एनके सेल के एंटी-ट्यूमर फ़ंक्शन को कैसे नियंत्रित करता है, और यह अध्ययन करना भी दिलचस्प हो सकता है कि एनके सेल ने घायल न्यूरॉन्स के उन्मूलन को कैसे नियंत्रित किया। प्रक्रिया का प्रदर्शन अली अहमदी करेंगे, जो मेरी प्रयोगशाला के एक पूर्व मास्टर छात्र हैं।प्राकृतिक हत्यारा या एनके सेल अलगाव और संस्कृति शुरू करने के लिए, माउस तिल्ली को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें बाँझ पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर होते हैं, फिर मूसल का उपयोग करके प्लीहा को समरूप करें। इसके बाद, कोशिकाओं को एक मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ पतला करें और मिश्रण को 50 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें। बाँझ पीबीएस का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए होमोजेनेट वॉल्यूम को 10 मिलीलीटर तक टॉप अप करें।हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके पतला होमोजेनेट के 10 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं की गणना करें। शेष कोशिकाओं को 500 जी पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें। फिर पूरक आरपीएमआई 1640 माध्यम में प्रति मिलीलीटर 10 से आठवीं कोशिकाओं पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।माउस एनके सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करके प्लीहा एनके कोशिकाओं को चुंबकीय रूप से शुद्ध करें और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एनके सेल शुद्धता की पुष्टि करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, इसके बाद 500 जी पर पांच मिनट में सेंट्रीफ्यूजेशन करें, फिर सतह पर तैरने वाले को हटा दें। पेलेट एनके कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, आईएल -2 और आईएल -15 पूरक आरपीएमआई 1640 संस्कृति माध्यम में इन कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।48 घंटों के लिए 96-वेल यू-बॉटम प्लेट में प्रति मिलीलीटर छठी एनके कोशिकाओं को दो बार कल्चर करें। एनके सेल उत्तेजना से 24 घंटे पहले, 96-वेल प्लेट को लैमिनिन के प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर के साथ कोट करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, घोल को हटा दें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में कुओं को हवा में सूखने दें।इसके बाद, एक प्रवण स्थिति में बोर्ड पर इच्छामृत्यु माउस को सुरक्षित करें। त्वचा को उठाएं और पृष्ठीय स्तंभ के साथ त्वचा को इंजेक्ट करें। लंबोसेराल जोड़ को काट लें और कैंची से काठ की रीढ़ से थैली को अलग करें।फिर कपाल दिशा में दोनों तरफ की मांसपेशियों और पसलियों को काटकर रीढ़ की हड्डी को अलग करें जब तक कि खोपड़ी का आधार न पहुंच जाए। एटलैंटुसीसीपिटल जोड़ में रीढ़ की हड्डी को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। इसके बाद, रीढ़ की हड्डी से मांसपेशियों और फैटी ऊतक को हटा दें।पृष्ठीय जड़ के माध्यम से रीढ़ की हड्डी से जुड़े इंटरवर्टेब्रल फोरामिना में पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि या डीआरजी तक पहुंच प्राप्त करने से पहले रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए कशेरुक स्तंभ को पिन करें और खोलें। इसके बाद, डीआरजी को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में काटें जो 10 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे पूरक डीएमईएम से भरा हो। फिर कमरे के तापमान पर 200 जी पर पांच मिनट के लिए तैयारी को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेजनेज IV और 2.4 यूनिट प्रति मिलीलीटर डिस्पेस II होता है। एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए, पूरक डीएमईएम माध्यम के पांच मिलीलीटर जोड़ें और 200 ग्राम पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें पांच मिनट के बाद, धीरे से पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को हटा दें और अवांछित सेल हानि से बचने के लिए सुपरनैटेंट के लगभग 100 माइक्रोलीटर छोड़ दें। इसके बाद, कोशिकाओं में एक मिलीलीटर पूरक डीएमईएम माध्यम जोड़ें और डीआरजी को धीरे से एकल सेल तैयारी में शामिल करने के लिए एक पिपेट गन और घटते आकार के तीन ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।बायोसेफ्टी कैबिनेट में काम करते समय, बाँझ पीबीएस में बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन या बीएसए को 15% की अंतिम सांद्रता तक पतला करें और शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस कम तापमान पर एक मिलीलीटर एलिकोट स्टोर करें। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बीएसए ढाल बनाने के लिए, बाँझ पीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें और फिर धीरे-धीरे ट्यूब के तल पर 15% बीएसए समाधान का एक मिलीलीटर वितरित करें। धीरे से पिपेट को हटाकर ढाल को बाधित करने से बचें।पी 200 पिपेट का उपयोग करके, ट्यूब के किनारे न्यूरॉन्स युक्त ट्राइट्यूरेटेड गैन्ग्लिया निलंबन को ढाल में जोड़ें। फिर 200 जी पर 12 मिनट के लिए बीएसए ढाल युक्त न्यूरॉन को सेंट्रीफ्यूज करने के लिए त्वरण और मंदी को न्यूनतम पर सेट करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पिपेट का उपयोग करके सभी सतह पर तैरने वाले को हटा दें और न्यूरोबेसल के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्लेट 10,000 न्यूरॉन्स प्रति कुएं एक लैमिनिन-लेपित फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट में।न्यूरॉन्स के लगाव की अनुमति देने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें। सह-संवर्धन शुरू करने के लिए, धीरे-धीरे न्यूरॉन संस्कृति से न्यूरोबेसल को हटा दें। आईएल -2 और आईएल -15 के साथ उत्तेजना के 48 घंटों के बाद, एनके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और न्यूरॉन संस्कृति में प्रति अच्छी तरह से पांचवें एनके कोशिकाओं में 10 जोड़ें।37 डिग्री सेल्सियस पर पूरक न्यूरोबेसल एमएक्स में कोशिकाओं को सह-संस्कृति। 48 घंटों के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार इकट्ठा करें और धोएं और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर 500 जी पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। कोशिकाओं को एक से 1,000 पतला व्यवहार्यता डाई ईफ्लोर 780 के साथ धुंधला करने से पहले सुपरनैटेंट को चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए छोड़ दें।जैसा कि दिखाया गया है, कोशिकाओं को धोएं और सेंट्रीफ्यूज करें, इसके बाद कोशिकाओं पर गैर-विशिष्ट साइटों को अवरुद्ध करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सीडी 1632 के साथ इलाज करें, इसके बाद पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार इकट्ठा और धोएं। धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन के अगले चक्र के बाद, कोशिकाओं को बीवी 421, एंटी-एनके -1.1, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट एंटी-एनकेपी 46, और फाइकोएरिथ्रिन एंटी-जीएम-सीएसएफ के साथ 15 मिनट के लिए दाग दें। एक बार फिर, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार इकट्ठा करें और धोएं, उन्हें सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें, फिर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एफएसीएस बफर और इम्यूनोफेनोटाइप एनके कोशिकाओं के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।जब अकेले सुसंस्कृत किया जाता है, तो एनके कोशिकाओं ने ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक या जीएम-सीएसएफ और एनकेपी 46 के बेसल स्तर को व्यक्त किया। जब नोसिसेप्टर बरकरार चूहों से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया, तो कैप्साइसिन उत्तेजना ने जीएम-सीएसएफ की एनके कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। कैप्साइसिन का एनके सेल सक्रियण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा जब नोसिसेप्टर एब्लेटेड चूहों से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया।एनकेपी 46 का स्तर अप्रभावित था। इस प्रोटोकॉल में प्रमुख कदम डीआरजी पृथक्करण और अलगाव है। विचार बुलबुला बनाने से बचने और सही आकार के पिपेट का उपयोग करके अधिकतम न्यूरोनल व्यवहार्यता रखना है।प्रोटोकॉल के बाद, अन्वेषक एफएसीएस शुद्ध कोशिकाओं में प्रतिलेख परिवर्तन को मापने के लिए आरएनए अनुक्रमण या क्यूपीसीआर का उपयोग कर सकते हैं, या वे साइटोकिन या न्यूरोपैप्टाइड्स के स्राव को मापने के लिए एलिसा का उपयोग कर सकते हैं। इस तरह के अंतःक्रिया से पता चलता है कि एनके सेल फ़ंक्शन संभवतः नोसिसेप्टर न्यूरॉन द्वारा ट्यून किया जाता है। और यह क्रॉसस्टॉक तंत्रिका चोट, जीवाणु और वायरल संक्रमण से लेकर घातकताओं तक फैली जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation और Mitochondrial परिवहन: लंबे durations पर hippocampal न्यूरॉन्स में लाइव इमेजिंग

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

संवेदी अंग अग्रदूत साबित कोशिकाओं के बरकरार में लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

कट लोड हो रहा है: रेटिना न्यूरॉन्स के बीच गैप जंक्शन अनुरेखक युग्मन की सीमा की जांच के लिए एक उपयोगी टूल

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

मानव pluripotent स्टेम सेल से Telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स की विशिष्टता

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

प्रेरित न्यूरॉन्स में वयस्क मानव मस्तिष्क की pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के वंश reprogramming

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

लड़की भ्रूण से अलगाव और Dissociated संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृति

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

रूट ganglia न्यूरॉन्स और विभेदित वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पृष्ठीय: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सह संस्कृति मॉडल परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

visualizing Axonal विकास शंकु पतन और जल्दी Amyloid β प्रभाव में कल्चरल माउस न्यूरॉन्स

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी और कपालीय मोटर ंयूरॉंस में PiggyBac वैक्टर का उपयोग में परिवर्तन

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...