Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824), og Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

De institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteene ved Université de Montréal (# 22053, # 22054) godkjente alle dyreprosedyrer. Se tabell 1 for en liste over løsninger og deres sammensetning og materialtabellen for en liste over materialer, utstyr og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. NK-celleisolasjon, kultur og stimulering
<ol><li>Generer nociceptor neuron intakt (littermate kontroll; TRPV1wt::D TA fl/wt) og ablerte (T...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies et al.11 fant at skadede nevroner oppregulerer RAE1. Via celle-celle-kontakt var NKG2D-uttrykkende NK-celler da i stand til å identifisere og eliminere RAE1+ -nevroner, som igjen begrenser kronisk smerte11. Gitt at NK-celler også uttrykker forskjellige neuropeptidreseptorer, og at disse neuropeptidene er kjent for sine immunmodulerende evner, synes det stadig viktigere å studere samspillet mellom NK-celler og nociceptor-nevroner in vitro</e...

Cellelegemene til sensoriske nevroner stammer fra dorsale rotganglier (DRG). DRG er lokalisert i det perifere nervesystemet (PNS), mellom ryggmargens dorsale horn og perifere nerveterminaler. Den pseudo-unipolare naturen til DRG-nevroner tillater overføring av informasjon fra den perifere grenen, som innerverer målvevet, til den sentrale grenen, som bærer den somatosensoriske informasjonen til ryggmargen1. Ved hjelp av spesialiserte ionkanalreseptorer registrerer førsteordens nevroner trusler fra patogener, allergener og forurensninger 2, noe som fører til tilstrømning av kationer (Na +, Ca2 +) og generering av et handlingspotensial 3,4,5.
Disse nevronene sender også antidromisk virkningspotensial mot periferien, hvor den første fareføleren hadde skjedd, noe som fører til lokal frigjøring av neuropeptider 1,4. Derfor tjener nociceptorneuronene som en beskyttende mekanisme, og varsler verten om miljøfare 4,5,6,7.
For å kommunisere med andreordens nevroner frigjør nociceptorene forskjellige nevrotransmittere (f.eks. Glutamat) og neuropeptider (f.eks. Kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP), substans P (SP) og vasoaktivt intestinalt peptid (VIP))6,7. Disse peptidene virker på kapillærene og fremmer plasma ekstravasasjon, ødem og lokal tilstrømning og modulering av immunceller 2,4,7.
De somatosensoriske og immunsystemene benytter et felles kommunikasjonssystem sammensatt av cytokiner og neuropeptider, og deres respektive kognate reseptorer4. Mens denne toveiskommunikasjonen bidrar til å beskytte mot fare og bevare homeostase, kan den også bidra til sykdomspatofysiologi4.
NK-celler er klassifisert som medfødte lymfoide celler og er spesialisert for å eliminere viralt infiserte celler. NK-cellefunksjonen styres av en balanse mellom stimulerende og hemmende reseptorer, inkludert aktiveringsreseptoren NKG2D8. Den endogene liganden til NKG2D, retinsyre tidlig induserbar1 (RAE1), uttrykkes av celler som gjennomgår stress som tumorigenese og infeksjon 8,9.
Nylige undersøkelser har vist at perifer nerveskade driver sensoriske nevroner for å uttrykke maladaptive molekyler som stathmin 2 (STMN2) og RAE1. Således, via celle-cellekontakt, ble NKG2D-uttrykkende NK-celler aktivert ved interaksjon med RAE1-uttrykkende nevroner. I sin tur var NK-celler i stand til å eliminere skadede nociceptorneuroner og stump smerteoverfølsomhet som normalt er forbundet med nerveskade10. I tillegg til NKG2D-RAE1-aksen uttrykker NK-celler de kognate reseptorene for forskjellige nociceptor-produserte mediatorer. Det er derfor mulig at disse mediatorene modulerer NK-celleaktivitet. Denne artikkelen presenterer en samkulturmetode for å undersøke biologien til nociceptor-nevron-NK-celleinteraksjonen. Denne tilnærmingen vil bidra til å fremme forståelsen av hvordan nociceptor-nevroner modulerer medfødte immuncelleresponser mot skade, infeksjon eller malignitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

Somatosensoriske nevroner har utviklet seg for å oppdage skadelige stimuli og aktivere defensive reflekser. Ved å dele kommunikasjonsmidler, justerer nociceptor-nevroner også vertsforsvaret ved å kontrollere immunsystemets aktivitet. Kommunikasjonen mellom disse systemene er for det meste adaptiv, og bidrar til å beskytte homeostase, det kan også føre til eller fremme utbruddet av kroniske sykdommer. Begge systemene utviklet seg for å tillate slik lokal interaksjon, som finnes i primær og sekundær lymfoid vev og slimhinner. Nylige studier har vist at nociceptorer direkte oppdager og reagerer på fremmede antigener, immuncelleavledede cytokiner og mikrober.
Nociceptoraktivering resulterer ikke bare i smerteoverfølsomhet og kløe, men senker nociceptorens avfyringsterskel, noe som fører til lokal frigjøring av neuropeptider. Peptidene som produseres av og frigjøres fra de perifere terminalene til nociceptorer, kan blokkere kjemotaksen og polarisasjonen av lymfocytter, kontrollere lokalisering, varighet og type betennelse. Nylig bevis viser at sensoriske nevroner samhandler med medfødte immunceller via celle-cellekontakt, for eksempel engasjerende gruppe 2D (NKG2D) reseptorer på naturlige morderceller (NK).
Gitt at NK-celler uttrykker de kognate reseptorene for forskjellige nociceptor-produserte mediatorer, kan det tenkes at nociceptorer bruker neuropeptider for å kontrollere aktiviteten til NK-celler. Her utarbeider vi en samkulturmetode for å studere nociceptor neuron-NK-celleinteraksjoner i en tallerken. Ved hjelp av denne tilnærmingen fant vi at lumbale nociceptor-nevroner reduserer NK-cellecytokinuttrykk. Samlet sett kan en slik reduksjonistisk metode være nyttig for å studere hvordan tumor-innerverende nevroner kontrollerer anticancerfunksjonen til NK-celler og hvordan NK-celler kontrollerer eliminering av skadede nevroner.

NK-celler ble magnetisk renset fra littermate control (TRPV1 wt::D TAfl/wt) mus splenocytter og stimulert (48 timer) med IL-2 og IL-15. NK-cellene ble deretter dyrket alene eller samdyrket med DRG-nevroner høstet fra nociceptornevron intakt (littermate kontroll; TRPV1wt::D TA fl/wt) eller ablerte (TRPV1cre::D TAfl/wt) mus. Cellene ble deretter utsatt for TRPV1-agonisten capsaicin (1 μM) eller dets kjøretøy. Etter 24 timers kokultur ble NK-cellene FACS-...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Nociceptor-nevroner og NK-celler samhandler aktivt i en inflammatorisk sammenheng. En samkulturell tilnærming gjør det mulig å studere dette samspillet.

Erting ut samspillet mellom naturlige morderceller og nociceptorneuroner

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Gitt at nociceptornevron utskiller ulike neuropeptider og at NK-cellen uttrykte reseptoren for disse neuropeptidene, bestemte vi oss for å utarbeide en samkulturmetode for å studere samspillet mellom NK-cellen og nociceptornevronene. En slik reduksjonistisk metode kan være nyttig for å studere hvordan nociceptornevron styrer antitumorfunksjonen til NK-cellen, og det kan også være interessant å studere hvordan NK-celler kontrollerte eliminering av skadede nevroner. Demonstrere prosedyren vil være Ali Ahmadi, en tidligere masterstudent fra laboratoriet mitt.For å starte den naturlige morderen eller NK-celleisolasjonen og kulturen, samle musemilten i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder 500 mikroliter steril PBS, og homogeniser deretter milten ved hjelp av en pestle. Fortynn deretter cellene med en milliliter steril PBS og filtrer blandingen gjennom en 50 mikron cellesil i et 50 milliliter konisk rør. Fyll opp det filtrerte homogenatvolumet til 10 milliliter ved hjelp av steril PBS.Tell cellene i 10 mikroliter av det fortynnede homogenatet ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuge de resterende cellene i fem minutter ved 500 G og fjern supernatanten. Deretter resuspenderer cellene ved 10 til de åttende cellene per milliliter i supplert RPMI 1640 medium.Rens milten NK-cellene magnetisk ved hjelp av et muse NK-celleisolasjonssett og bekreft NK-cellerenhet ved hjelp av flowcytometri. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer, etterfulgt av sentrifugering på fem minutter ved 500 G, og fjern deretter supernatanten. For å stimulere de pelleterte NK-cellene, resuspendere disse cellene i IL-2 og IL-15 supplert RPMI 1640 kulturmedium.Kultur to ganger 10 til sjette NK-celler per milliliter i en 96-brønns U-bunnplate i 48 timer. 24 timer før NK-cellestimuleringen, belegg 96-brønnsplaten med 100 mikroliter per brønn laminine og inkuber den i 45 minutter ved 37 grader Celsius. Etter inkubering, fjern løsningen og la brønnene lufttørke i biosikkerhetsskapet.Deretter fester du den avlivede musen på brettet i utsatt stilling. Løft huden og snitt huden langs dorsalkolonnen. Klipp av lumbosakralleddet og skille sakrummet fra lumbale ryggraden med saks.Skill deretter ryggraden ved å kutte musklene og ribbeina på begge sider i kranial retning til bunnen av skallen er nådd. Bruk saks til å kutte av ryggraden ved atlantooccipital leddet. Deretter fjerner du muskelen og fettvevet fra ryggraden.Pin og åpne vertebral kolonnen for å fjerne ryggmargen før du får tilgang til dorsal rot ganglion eller DRG i intervertebral foramina koblet til ryggmargen gjennom dorsalroten. Deretter høster du DRG-ene i et 15 milliliter konisk rør fylt med 10 milliliter iskaldt supplert DMEM. Sentrifuger deretter preparatet i fem minutter ved 200 G ved romtemperatur og fjern supernatanten.Legg til en 250 mikroliter PBS som inneholder en milligram per milliliter kollagenase IV og 2,4 enheter per milliliter dispase II.Inkuber denne DRG med kollagenase-dispaseløsning i 80 minutter med mild omrøring. For å inaktivere enzymene, tilsett fem milliliter supplert DMEM-medium og sentrifuger løsningen ved 200 G.Etter fem minutter, fjern supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette og la rundt 100 mikroliter av supernatanten for å unngå uønsket celletap. Deretter legger du til ett milliliter supplert DMEM-medium til cellene og bruker en pipettepistol og tre glass Pasteur-pipetter av avtagende størrelser for å forsiktig triturere DRG i et enkelt cellepreparat.Mens du arbeider i et biosikkerhetsskap, fortynn bovint serumalbumin eller BSA i steril PBS til en endelig konsentrasjon på 15% og lagre en milliliter aliquots ved minus 20 grader Celsius. For å lage en BSA-gradient i et 15 milliliter konisk rør, tilsett to milliliter steril PBS og dispenser deretter sakte en milliliter 15% BSA-løsning i bunnen av røret. Unngå å forstyrre gradienten ved å fjerne pipetten forsiktig.Ved hjelp av en P200-pipette, tilsett den triturerte ganglia-suspensjonen som inneholder nevronene på siden av røret inn i gradienten. Sett deretter akselerasjonen og retardasjonen på minimum for å sentrifugere nevronet som inneholder BSA-gradienten i 12 minutter ved 200 G.Etter sentrifugering, fjern all supernatanten ved hjelp av en pipette og resuspender cellene i 500 mikroliter Neurobasal. Plate 10.000 nevroner per brønn i en lamininbelagt flat bunn 96-brønnplate.For å tillate vedlegg av nevronene, inkuberer 96-brønnplaten over natten ved 37 grader Celsius. For å starte co-dyrking, fjern sakte Neurobasal fra nevronkulturen. Etter 48 timers stimulering med IL-2 og IL-15, resuspender NK-cellene og legger 10 til de femte NK-cellene per brønn til nevronkulturen.Kokultur cellene i supplert Neurobasal MX ved 37 grader Celsius. Etter 48 timer, samle og vask cellene tre ganger med PBS og sentrifuger dem i fem minutter ved 500 G ved fire grader Celsius. Kast supernatanten før du flekker cellene med en til 1.000 fortynnet levedyktighetsvæske eFluor 780 i 15 minutter ved fire grader Celsius.Vask og sentrifuger cellene som demonstrert, etterfulgt av behandling med CD 1632 i 15 minutter ved fire grader Celsius for å blokkere ikke-spesifikke steder på cellene, etterfulgt av å samle og vaske cellene med PBS tre ganger. Etter neste syklus med vask og sentrifugering, flekk cellene med BV421, anti-NK-1.1, fluoresceinisotiocyanat anti-NKp46 og phycoerythrin anti-GM-CSF i 15 minutter. Igjen, samle og vask cellene tre ganger med PBS, sentrifuger dem og kast supernatanten, og resuspender deretter cellene i 500 mikroliter FACS-buffer og immunofenotype NK-cellene ved hjelp av flowcytometri.Når de ble dyrket alene, uttrykte NK-celler basale nivåer av granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor eller GM-CSF og NKp46. Når kokulturert med DRG-nevroner høstet fra nociceptor intakte mus, reduserte capsaicinstimulering NK-cellers ekspresjon av GM-CSF. Capsaicin hadde ingen innvirkning på NK-celleaktiveringer når det ble dyrket sammen med DRG-nevroner høstet fra nociceptor-ablerte mus.Nivået på NKp46 var upåvirket. De viktigste trinnene i denne protokollen er DRG-dissosiasjon og isolasjon. Tanken er å beholde maksimal nevronal levedyktighet ved å unngå å lage boble og bruke pipette i riktig størrelse.Etter protokollen kan etterforsker bruke RNA-sekvensering eller qPCR for å måle transkripsjonsendring i FACS-rensede celler, eller de kan bruke ELISA til å måle sekresjonen av cytokin eller neuropeptider. Et slikt samspill avslører at NK-cellefunksjonen sannsynligvis er innstilt av nociceptornevron. Og denne crosstalken kan være viktig i biologiske prosesser som spenner fra nerveskade, bakteriell og virusinfeksjon, helt til maligniteter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-lasting: et nyttig verktøy for å undersøke graden av Gap Junction Tracer kobling mellom Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

En engulfment analysen: En protokoll for å vurdere samspillet mellom CNS Fagocytter og Neuroner

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolasjon og kultur av Spaltet sensoriske nevroner Fra Chick embryo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...