Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöddes av The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair-programmet (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) och Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

De institutionella djurvårds- och användningskommittéerna vid Université de Montréal (#22053, #22054) godkände alla djurförsök. Se tabell 1 för en förteckning över lösningar och deras sammansättning och materialförteckningen för en förteckning över material, utrustning och reagenser som används i detta protokoll.
1. NK-cellisolering, odling och stimulering
<ol><li>Generera nociceptorneuron intakt (kullmatkontroll; TRPV1<sup...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies et al.11 fann att skadade nervceller uppreglerar RAE1. Via cell-cellkontakt kunde NKG2D-uttryckande NK-celler sedan identifiera och eliminera RAE1+ neuroner, vilket i sin tur begränsar kronisk smärta11. Med tanke på att NK-celler också uttrycker olika neuropeptidreceptorer, och att dessa neuropeptider är kända för sin immunmodulerande förmåga, verkar det allt viktigare att studera interaktionen mellan NK-celler och nociceptorneuroner ...

Cellkropparna hos sensoriska neuroner har sitt ursprung i dorsalrotganglierna (DRG). DRG är belägna i det perifera nervsystemet (PNS), mellan ryggmärgs dorsala horn och de perifera nervterminalerna. Den pseudo-unipolära naturen hos DRG-neuroner möjliggör överföring av information från den perifera grenen, som innerverar målvävnaden, till den centrala grenen, som bär den somatosensoriska informationen till ryggmärgen1. Med hjälp av specialiserade jonkanalreceptorer känner första ordningens neuroner av hot från patogener, allergener och föroreningar2, vilket leder till tillströmning av katjoner (Na+, Ca2+) och generering av en åtgärdspotential 3,4,5.
Dessa nervceller skickar också antidromisk åtgärdspotential mot periferin, där den initiala faroavkänningen hade inträffat, vilket leder till lokal frisättning av neuropeptider 1,4. Därför fungerar nociceptorneuronerna som en skyddsmekanism och varnar värden för miljöfara 4,5,6,7.
För att kommunicera med andra ordningens neuroner frisätter nociceptorerna olika neurotransmittorer (t.ex. glutamat) och neuropeptider (t.ex. kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP), substans P (SP) och vasoaktiv tarmpeptid (VIP))6,7. Dessa peptider verkar på kapillärer och främjar plasmaextravasation, ödem och lokal tillströmning och modulering av immunceller 2,4,7.
De somatosensoriska och immunsystemen använder ett delat kommunikationssystem som består av cytokiner och neuropeptider och deras respektive kognatreceptorer4. Medan denna dubbelriktade kommunikation hjälper till att skydda mot fara och bevara homeostas, kan det också bidra till sjukdomspatofysiologi4.
NK-celler klassificeras som medfödda lymfoida celler och är specialiserade för att eliminera virusinfekterade celler. NK-cellfunktionen styrs av en balans mellan stimulerande och hämmande receptorer, inklusive den aktiverande receptorn NKG2D8. Den endogena liganden av NKG2D, retinsyra tidigt inducerbar1 (RAE1), uttrycks av celler som genomgår stress såsom tumorigenes och infektion 8,9.
Nya undersökningar har visat att perifer nervskada driver sensoriska nervceller att uttrycka maladaptiva molekyler som stathmin 2 (STMN2) och RAE1. Således, via cell-cellkontakt, aktiverades NKG2D-uttryckande NK-celler genom interaktion med RAE1-uttryckande neuroner. I sin tur kunde NK-celler eliminera skadade nociceptorneuroner och trubbig smärtöverkänslighet som normalt är förknippad med nervskada10. Förutom NKG2D-RAE1-axeln uttrycker NK-celler de kognata receptorerna för olika nociceptorproducerade mediatorer. Det är därför möjligt att dessa medlare modulerar NK-cellaktivitet. Denna artikel presenterar en samodlingsmetod för att undersöka biologin för nociceptorneuron-NK-cellinteraktionen. Detta tillvägagångssätt hjälper till att främja förståelsen för hur nociceptorneuroner modulerar medfödda immuncellsvar mot skada, infektion eller malignitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

Somatosensoriska nervceller har utvecklats för att upptäcka skadliga stimuli och aktivera defensiva reflexer. Genom att dela kommunikationsmedel ställer nociceptorneuroner också värdförsvar genom att kontrollera immunsystemets aktivitet. Kommunikationen mellan dessa system är mestadels adaptiv, vilket hjälper till att skydda homeostas, det kan också leda till eller främja uppkomsten av kroniska sjukdomar. Båda systemen utvecklades tillsammans för att möjliggöra sådan lokal interaktion, som finns i primära och sekundära lymfoida vävnader och slemhinnor. Nya studier har visat att nociceptorer direkt upptäcker och svarar på främmande antigener, immuncellsderiverade cytokiner och mikrober.
Nociceptoraktivering resulterar inte bara i smärtöverkänslighet och klåda, utan sänker nociceptorbränningströskeln, vilket leder till lokal frisättning av neuropeptider. Peptiderna som produceras av och frigörs från de perifera terminalerna hos nociceptorer kan blockera kemotaxi och polarisering av lymfocyter, kontrollera lokalisering, varaktighet och typ av inflammation. Nya bevis visar att sensoriska nervceller interagerar med medfödda immunceller via cell-cellkontakt, till exempel engagerande grupp 2D (NKG2D) receptorer på naturliga mördarceller (NK).
Med tanke på att NK-celler uttrycker de kognata receptorerna för olika nociceptorproducerade mediatorer är det tänkbart att nociceptorer använder neuropeptider för att kontrollera aktiviteten hos NK-celler. Här tar vi fram en samodlingsmetod för att studera nociceptorneuron-NK-cellinteraktioner i en skål. Med hjälp av detta tillvägagångssätt fann vi att lumbal nociceptorneuroner minskar NK-cellcytokinuttryck. Sammantaget kan en sådan reduktionistisk metod vara användbar för att studera hur tumörinnerverande nervceller styr NK-cellernas anticancerfunktion och hur NK-celler styr elimineringen av skadade nervceller.

NK-celler renades magnetiskt från kullmatkontroll (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) möss splenocyter och stimulerades (48 h) med IL-2 och IL-15. NK-cellerna odlades sedan ensamma eller samodlades med DRG-neuroner skördade från nociceptorneuron intakt (kullmatkontroll; TRPV1wt::D TA fl/wt) eller ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) möss. Cellerna exponerades sedan för TRPV1-agonistkapseln (1 μM) eller dess vehikel. Efter 24 timmars samodling var NK-cellerna FACS-ren...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Nociceptorneuroner och NK-celler interagerar aktivt i ett inflammatoriskt sammanhang. En samkulturell strategi gör det möjligt att studera detta samspel.

Retar ut samspelet mellan naturliga mördarceller och nociceptorneuroner

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Med tanke på att nociceptorneuron utsöndrar olika neuropeptider och att NK-cellen uttryckte receptorn för dessa neuropeptid, bestämde vi oss för att utforma en samodlingsmetod för att studera samspelet mellan NK-cellen och nociceptorneuronerna. En sådan reduktionistisk metod skulle kunna vara användbar för att studera hur nociceptorneuron styr antitumörfunktionen hos NK-cellen, och det kan också vara intressant att studera hur NK-cellen styrde elimineringen av skadade nervceller. Demonstrerar proceduren kommer att vara Ali Ahmadi, en tidigare masterstudent från mitt labb.För att påbörja den naturliga mördaren eller NK-cellisoleringen och odlingen, samla mjälten i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 mikroliter steril PBS och homogenisera sedan mjälten med en stöt. Späd sedan cellerna med en milliliter steril PBS och filtrera blandningen genom en 50 mikron cellsil i ett 50 ml koniskt rör. Fyll på den filtrerade homogenatvolymen till 10 ml med steril PBS.Räkna cellerna i 10 mikroliter av det utspädda homogenatet med användning av en hemocytometer. Centrifugera de återstående cellerna i fem minuter vid 500 G och ta bort supernatanten. Suspendera sedan cellerna vid 10 till de åttonde cellerna per milliliter i kompletterat RPMI 1640-medium.Magnetiskt rena mjälten NK-cellerna med hjälp av en mus NK-cellisoleringssats och bekräfta NK-cellrenhet med hjälp av flödescytometri. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, följt av centrifugering vid fem minuter vid 500 G, ta sedan bort supernatanten. För att stimulera de pelleterade NK-cellerna, återsuspendera dessa celler i IL-2 och IL-15 kompletterat RPMI 1640 odlingsmedium.Odla två gånger 10 till den sjätte NK-cellerna per milliliter i en 96-brunns U-bottenplatta i 48 timmar. 24 timmar före NK-cellstimuleringen, täck 96-brunnsplattan med 100 mikroliter per brunn laminin och inkubera den i 45 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubation, ta bort lösningen och låt brunnarna lufttorka i biosäkerhetsskåpet.Säkra sedan den avlivade musen på brädet i ett benäget läge. Lyft huden och skär huden längs dorsalkolonnen. Klipp av lumbosakralleden och separera sakrummet från ländryggen med sax.Separera sedan ryggraden genom att skära musklerna och revbenen på båda sidor i kranialriktningen tills basen av skallen är nådd. Använd sax för att skära av ryggraden vid atlantooccipitalleden. Ta sedan bort muskeln och fettvävnaden från ryggraden.Stift och öppna ryggraden för att ta bort ryggmärgen innan du får tillgång till dorsalrot ganglion eller DRG i den intervertebrala foramina som är ansluten till ryggmärgen genom dorsalroten. Skörda sedan DRG: erna i ett 15 ml koniskt rör fyllt med 10 ml iskallt kompletterat DMEM. Centrifugera sedan preparatet i fem minuter vid 200 G vid rumstemperatur och ta bort supernatanten.Tillsätt en 250 mikroliter PBS som innehåller ett milligram per milliliter kollagenas IV och 2,4 enheter per milliliter dispase II.Inkubera denna DRG med kollagenas-dispase-lösning i 80 minuter med mild omrörning. För att inaktivera enzymerna, tillsätt fem milliliter kompletterat DMEM-medium och centrifugera lösningen vid 200 G.Efter fem minuter, ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och lämna cirka 100 mikroliter av supernatanten för att undvika oönskad cellförlust. Tillsätt sedan ett milliliter kompletterat DMEM-medium till cellerna och använd en pipettpistol och tre pasteurpipetter av glas av minskande storlekar för att försiktigt trituera DRG till en enda cellberedning.När du arbetar i ett biosäkerhetsskåp, späd bovint serumalbumin eller BSA i steril PBS till en slutlig koncentration på 15% och förvara en milliliter alikvoter vid minus 20 grader Celsius. För att skapa en BSA-gradient i ett 15 ml koniskt rör, tillsätt två milliliter steril PBS och dosera sedan långsamt en milliliter 15% BSA-lösning i botten av röret. Undvik att störa lutningen genom att försiktigt ta bort pipetten.Använd en P200-pipett och tillsätt den triturerade ganglisuspensionen som innehåller neuronerna på sidan av röret i gradienten. Ställ sedan in accelerationen och retardationen på ett minimum för att centrifugera neuronen som innehåller BSA-gradienten i 12 minuter vid 200 G.Efter centrifugeringen, ta bort all supernatant med en pipett och återsuspendera cellerna i 500 mikroliter Neurobasal. Platta 10 000 neuroner per brunn i en lamininbelagd platt botten 96-brunnsplatta.För att möjliggöra fastsättning av neuronerna, inkubera 96-brunnsplattan över natten vid 37 grader Celsius. För att börja samodling, ta långsamt bort Neurobasal från neuronkulturen. Efter 48 timmars stimulering med IL-2 och IL-15, återsuspendera NK-cellerna och tillsätt 10 till de femte NK-cellerna per brunn till neuronkulturen.Samodling av cellerna i kompletterad Neurobasal MX vid 37 grader Celsius. Efter 48 timmar, samla och tvätta cellerna tre gånger med PBS och centrifugera dem i fem minuter vid 500 G vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten innan du färgar cellerna med en till 1 000 utspädd viabilitetsfärg eFluor 780 i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Tvätta och centrifugera cellerna enligt demonstration, följt av behandling med CD 1632 i 15 minuter vid fyra grader Celsius för att blockera icke-specifika platser på cellerna, följt av att samla och tvätta cellerna med PBS tre gånger. Efter nästa cykel av tvätt och centrifugering, fläcka cellerna med BV421, anti-NK-1.1, fluoresceinisotiocyanat anti-NKp46 och phycoerythrin anti-GM-CSF i 15 minuter. Återigen, samla och tvätta cellerna tre gånger med PBS, centrifugera dem och kassera supernatanten och sedan återsuspendera cellerna i 500 mikroliter FACS-buffert och immunofenotyp NK-cellerna med hjälp av flödescytometri.När de odlades ensamma uttryckte NK-celler basala nivåer av granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor eller GM-CSF och NKp46. När de odlades tillsammans med DRG-neuroner skördade från nociceptor intakta möss, minskade capsaicinstimulering NK-cellernas uttryck av GM-CSF. Capsaicin hade ingen inverkan på NK-cellaktiveringar när de odlades tillsammans med DRG-neuroner skördade från nociceptor-ablerade möss.Nivån på NKp46 påverkades inte. De viktigaste stegen i detta protokoll är DRG-dissociation och isolering. Tanken är att hålla maximal neuronal livskraft genom att undvika att göra bubbla och använda pipett i rätt storlek.Efter protokollet kan utredaren använda RNA-sekvensering eller qPCR för att mäta transkriptförändring i FACS-renade celler, eller så kan de använda ELISA för att mäta utsöndringen av cytokin eller neuropeptider. Ett sådant samspel avslöjar att NK-cellfunktionen sannolikt är inställd av nociceptorneuron. Och denna överhörning kan vara viktig i biologiska processer som sträcker sig från nervskada, bakteriell och virusinfektion, hela vägen till maligniteter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: ett användbart verktyg för att undersöka omfattningen av Gap Junction Tracer kopplingen mellan näthinnan nervceller

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

En omvälvning Analys: Ett protokoll för att bedöma samspelet mellan CNS fagocyter och nervceller

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolering och odling av dissocierade sensoriska neuroner från kycklingembryon

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrotsganglier Neuroner och differentierade Fett-härledda Stem Cells: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell för att studera perifera nerver Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisera Axonal tillväxt Cone kollaps och tidiga Amyloid β effekter i odlade mus nervceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...