Name: teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Bu çalışma, Araştırma Fonu'nda Yeni Sınırlar (NFRFE201901326), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (162211, 461274, 461275), Kanada İnovasyon Vakfı (37439), Kanada Araştırma Başkanı programı (950-231859), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2019-06824) ve Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) tarafından desteklenmiştir.

Université de Montréal'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (#22053, #22054) tüm hayvan prosedürlerini onayladı. Çözümlerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e ve bu protokolde kullanılan malzemelerin, ekipmanların ve reaktiflerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. NK hücre izolasyonu, kültürü ve stimülasyonu
<ol><li>Nosiseptör nöronu bozulmadan üretin (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt...

<ol>
	<li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain.">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li><li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia.">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li><li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors.">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li><li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology.">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li><li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity.">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li><li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis.">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li><li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier.">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li><li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor.">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li><li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+or+adaptive+immunity?+The+example+of+natural+killer+cells.">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li><li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury.">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333 (2021).</li><li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis.">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li><li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation.">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism.">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li></ol>

Davies ve ark.11 , yaralı nöronların RAE1'i yukarı regüle ettiğini bulmuşlardır. Hücre-hücre teması yoluyla , NKG2D eksprese eden NK hücreleri daha sonra RAE1 + nöronlarını tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve bu da kronik ağrıyı sınırlayabilir11. NK hücrelerinin ayrıca çeşitli nöropeptit reseptörlerini de eksprese ettiği ve bu nöropeptitlerin immünomodülatör yetenekleri ile bilindiği göz önüne alındığında, N...

Duyusal nöronların hücre gövdeleri dorsal kök ganglionlarından (DRG) kaynaklanır. DRG, periferik sinir sisteminde (PNS), omuriliğin dorsal boynuzu ile periferik sinir terminalleri arasında bulunur. DRG nöronlarının psödo-unipolar doğası, hedef dokuyu innerve eden periferik daldan, somatosensoriyel bilgiyi omuriliğe taşıyan merkezi dala bilgi aktarımına izin verir1. Özel iyon kanalı reseptörleri kullanarak, birinci dereceden nöronlar patojenlerin, alerjenlerin ve kirleticilerinoluşturduğu tehditleri algılar 2, bu da katyonların akışına (Na +, Ca2 +) ve bir aksiyon potansiyelinin üretilmesine yol açar 3,4,5.
Bu nöronlar ayrıca, ilk tehlike algılamasının gerçekleştiği çevreye doğru antidromik etki potansiyeli gönderir ve bu da nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar 1,4. Bu nedenle, nosiseptör nöronlar, konağı çevresel tehlikeye karşı uyaran koruyucu bir mekanizma görevi görür 4,5,6,7.
İkinci dereceden nöronlarla iletişim kurmak için, nosiseptörler çeşitli nörotransmiterleri (örneğin, glutamat) ve nöropeptitleri (örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), madde P (SP) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP))6,7 serbest bırakır. Bu peptitler kılcal damarlara etki eder ve plazma ekstravazasyonunu, ödemi ve bağışıklık hücrelerinin lokal akışını ve modülasyonunu teşvik eder 2,4,7.
Somatosensoriyel ve bağışıklık sistemleri, sitokinler ve nöropeptitlerden ve bunların ilgili konyak reseptörlerinden oluşan ortak bir iletişim sistemi kullanır4. Bu çift yönlü iletişim, tehlikeden korunmaya ve homeostazı korumaya yardımcı olurken, aynı zamanda hastalık patofizyolojisine de katkıda bulunabilir4.
NK hücreleri doğuştan gelen lenfoid hücreler olarak sınıflandırılır ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri ortadan kaldırmak için uzmanlaşmıştır. NK hücre fonksiyonu, aktive edici reseptör NKG2D8 de dahil olmak üzere uyarıcı ve inhibitör reseptörlerin bir dengesi tarafından yönetilir. NKG2D'nin endojen ligandı olan retinoik asit erken indüklenebilir1 (RAE1), tümörigenez ve enfeksiyon 8,9 gibi stres altındaki hücreler tarafından eksprese edilir.
Son zamanlarda yapılan araştırmalar, periferik sinir hasarının duyusal nöronları stathmin 2 (STMN2) ve RAE1 gibi uyumsuz molekülleri eksprese etmeye yönlendirdiğini göstermiştir. Böylece, hücre-hücre teması yoluyla, NKG2D eksprese eden NK hücreleri, RAE1 eksprese eden nöronlarla etkileşim yoluyla aktive edildi. Buna karşılık, NK hücreleri yaralı nosiseptör nöronları ve normalde sinir hasarı ile ilişkili künt ağrı aşırı duyarlılığını ortadan kaldırabildi10. NKG2D-RAE1 eksenine ek olarak, NK hücreleri çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese eder. Bu nedenle, bu mediatörlerin NK hücre aktivitesini modüle etmeleri mümkündür. Bu yazıda nosiseptör nöron-NK hücre etkileşiminin biyolojisini araştırmak için bir ko-kültür yöntemi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, nosiseptör nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarını yaralanmaya, enfeksiyona veya maligniteye nasıl modüle ettiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 017769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Cat no: 009669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Cat no: 504167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-mouse NK-1.1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 12430112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (50 &#956;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: A3160702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria toxinfl/fl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: SH3057402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 13-678-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat no: 07-200-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: CLS2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 04942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse NKp46</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 03690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat no: 470236-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat no: 02-0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>Cat no: 03-50/31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: A14867-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-15</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant IL-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat no: 21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat no: 13257-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 450-51-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat no: 210-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>Cat no: 19855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 108732</td>
			<td>Clone PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 137606</td>
			<td>Clone 29A1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRPV1Cre</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 505406</td>
			<td>Clone MP1-22E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers and dissection tools.</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Shaped-bottom 96-well plate</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat no: 101319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability Dye eFlour-780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

teasing out the interplay between natural killer cells and nociceptor neurons

Somatosensoriyel nöronlar, zararlı uyaranları tespit etmek ve savunma reflekslerini aktive etmek için evrimleşmiştir. İletişim araçlarını paylaşarak, nosiseptör nöronlar ayrıca bağışıklık sisteminin aktivitesini kontrol ederek konakçı savunmasını da ayarlar. Bu sistemler arasındaki iletişim çoğunlukla adaptiftir, homeostazı korumaya yardımcı olur, ayrıca kronik hastalıkların başlangıcına yol açabilir veya teşvik edebilir. Her iki sistem de, birincil ve ikincil lenfoid dokularda ve mukozada bulunan bu tür lokal etkileşime izin vermek için birlikte evrimleşmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nosiseptörlerin yabancı antijenleri, bağışıklık hücresi kaynaklı sitokinleri ve mikropları doğrudan tespit ettiğini ve bunlara yanıt verdiğini göstermiştir.
Nosiseptör aktivasyonu sadece ağrı aşırı duyarlılığı ve kaşıntı ile sonuçlanmaz, aynı zamanda nosiseptör ateşleme eşiğini düşürür ve nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar. Nosiseptörlerin periferik terminalleri tarafından üretilen ve salınan peptitler, lenfositlerin kemotaksisini ve polarizasyonunu bloke edebilir, inflamasyonun lokalizasyonunu, süresini ve tipini kontrol edebilir. Son kanıtlar, duyusal nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücreleriyle hücre-hücre teması yoluyla etkileşime girdiğini, örneğin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerindeki grup 2D (NKG2D) reseptörlerini kullandığını göstermektedir.
NK hücrelerinin çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese ettiği göz önüne alındığında, nosiseptörlerin NK hücrelerinin aktivitesini kontrol etmek için nöropeptitler kullandıkları düşünülebilir. Burada, bir tabaktaki nosiseptör nöron-NK hücre etkileşimlerini incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, lomber nosiseptör nöronların NK hücre sitokin ekspresyonunu azalttığını bulduk. Genel olarak, böyle bir indirgemeci yöntem, tümör innerve edici nöronların NK hücrelerinin antikanser fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve NK hücrelerinin yaralı nöronların ortadan kaldırılmasını nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir.

NK hücreleri, çöp arkadaşı kontrolünden (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) farelerin plenositlerinden manyetik olarak saflaştırıldı ve IL-2 ve IL-15 ile uyarıldı (48 saat). NK hücreleri daha sonra tek başlarına kültürlendi veya nosiseptör nörondan sağlam bir şekilde toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendi (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler. Hücreler daha sonra TRPV1 ago...

Watch this Scientific Journal Video about Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons at JoVE.com

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Nosiseptör nöronlar ve NK hücreleri aktif olarak enflamatuar bir bağlamda etkileşime girer. Bir ortak kültür yaklaşımı, bu etkileşimi incelemeyi sağlar.

Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Nosiseptör nöronun çeşitli nöropeptitler salgıladığı ve NK hücresinin bu nöropeptitler için reseptörü ifade ettiği göz önüne alındığında, NK hücresi ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirmeye karar verdik. Böyle bir indirgemeci yöntem, nosiseptör nöronun NK hücresinin anti-tümör fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir ve NK hücresinin yaralı nöronların eliminasyonunu nasıl kontrol ettiğini incelemek de ilginç olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Ali Ahmedi olacak.Doğal katil veya NK hücre izolasyonuna ve kültürüne başlamak için, fare dalağını 500 mikrolitre steril PBS içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın, ardından bir havane kullanarak dalağı homojenleştirin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre steril PBS ile seyreltin ve karışımı 50 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Steril PBS kullanarak filtrelenmiş homojenat hacmini 10 mililitreye yükseltin.Bir hemositometre kullanarak seyreltilmiş homojenatın 10 mikrolitresindeki hücreleri sayın. Kalan hücreleri 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücreleri 10'da mililitre başına sekizinci hücrelere takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın.Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak saflaştırın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücresinin saflığını onaylayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 500 G'de beş dakikada santrifüjleme yapın, ardından süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş NK hücrelerini uyarmak için, bu hücreleri IL-2 ve IL-15 takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında yeniden askıya alın.48 saat boyunca 96 kuyucuklu bir U alt plakasında mililitre başına altıncı NK hücrelerine iki kez 10 kez kültür yapın. NK hücresi stimülasyonundan 24 saat önce, 96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 mikrolitre laminin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.Ardından, ötenazi faresini tahtaya eğilimli bir konumda sabitleyin. Cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.Daha sonra kafatasının tabanına ulaşılana kadar her iki taraftaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın. Atlantioksipital eklemdeki omurgayı kesmek için makas kullanın. Ardından, kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.Dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı intervertebral foraminadaki dorsal kök ganglionuna veya DRG'ye erişmeden önce omuriliği çıkarmak için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. Daha sonra, DRG'leri 10 mililitre buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra hazırlığı oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.Mililitre kollajenaz IV başına bir miligram ve mililitre dispase II başına 2.4 birim içeren 250 mikrolitre PBS ekleyin.Bu DRG'yi hafif ajitasyonla 80 dakika boyunca kollajenaz-dispaz çözeltisi ile inkübe edin. Enzimleri inaktive etmek için, beş mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve çözeltiyi 200 G'de santrifüj edin.Beş dakika sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın ve istenmeyen hücre kaybını önlemek için süpernatantın yaklaşık 100 mikrolitresini bırakın. Daha sonra, hücrelere bir mililitre takviyeli DMEM ortamı ekleyin ve DRG'yi tek bir hücre preparatına nazikçe tritüre etmek için bir pipet tabancası ve azalan boyutlarda üç cam Pasteur pipeti kullanın.Bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, sığır serum albümini veya BSA'yı steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin ve eksi 20 santigrat derecede bir mililitre alikot saklayın. 15 mililitrelik konik bir tüpte bir BSA gradyanı oluşturmak için, iki mililitre steril PBS ekleyin ve ardından tüpün dibine bir mililitre% 15 BSA çözeltisi yavaşça dağıtın. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.Bir P200 pipet kullanarak, nöronları içeren üçlü gangliyon süspansiyonunu tüpün yan tarafına gradyana ekleyin. Daha sonra, BSA gradyanını içeren nöronu 200 G'de 12 dakika boyunca santrifüj etmek için hızlanmayı ve yavaşlamayı minimuma ayarlayın.Santrifüjlemeyi takiben, bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre Neurobazal'da yeniden askıya alın. Laminin kaplı düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 10.000 nöron plakası.Nöronların bağlanmasına izin vermek için, 96 kuyucuklu plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Birlikte kültürlemeye başlamak için, nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın. IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra, NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne kuyu başına beşinci NK hücrelerine 10 ekleyin.Takviyeli Neurobazal MX'teki hücreleri 37 santigrat derecede birlikte kültüre alın. 48 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın ve dört santigrat derecede 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri bir ila 1.000 seyreltilmiş canlılık boyası eFluor 780 ile dört santigrat derecede 15 dakika boyamadan önce süpernatantı atın.Hücreleri gösterildiği gibi yıkayın ve santrifüj yapın, ardından hücreler üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca CD 1632 ile muamele edin, ardından hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın. Bir sonraki yıkama ve santrifüjleme döngüsünden sonra, hücreleri BV421, anti-NK-1.1, floresein izotiyosiyanat anti-NKp46 ve fikoeritrin anti-GM-CSF ile 15 dakika boyunca lekeleyin. Bir kez daha, hücreleri PBS ile üç kez toplayın ve yıkayın, onları santrifüj edin ve süpernatanı atın, ardından hücreleri 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisini kullanarak NK hücrelerini immünofenotipleyin.Tek başına kültürlendiğinde, NK hücreleri bazal granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktör veya GM-CSF ve NKp46 seviyelerini eksprese etti. Nosiseptör sağlam farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde, kapsaisin stimülasyonu GM-CSF'nin NK hücrelerinin ekspresyonunu azalttı. Kapsaisin, nosiseptör ablatlı farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde NK hücre aktivasyonları üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır.NKp46 seviyesi etkilenmedi. Bu protokoldeki temel adımlar DRG ayrışması ve yalıtımıdır. Buradaki fikir, kabarcık yapmaktan kaçınarak ve doğru boyutta pipet kullanarak maksimum nöronal canlılığı korumaktır.Protokolden sonra, araştırmacı FACS saflaştırılmış hücrelerdeki transkript değişimini ölçmek için RNA dizilimini veya qPCR'yi kullanabilir veya sitokin veya nöropeptitlerin salgılanmasını ölçmek için ELISA'yı kullanabilir. Bu tür bir etkileşim, NK hücre fonksiyonunun muhtemelen nosiseptör nöron tarafından ayarlandığını ortaya koymaktadır. Ve bu çapraz konuşma, sinir hasarından, bakteriyel ve viral enfeksiyondan, malignitelere kadar uzanan biyolojik süreçlerde önemli olabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...