Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

تعترف A.N.K. بالدعم المقدم من NIH R33 CA225458 و R35 GM119455. نشكر مختبري Kettenbach و Gerber على مناقشتهما المفيدة.

ملاحظة: يتم توليد PIBs كما هو موضح من قبل Moorhead et al. ، حيث يقترن 1 ملغ من microcystin وحوالي 6 مل من sepharose لتوليد PIBs بقدرة ربط تصل إلى 5 mg / mL17.
1. إعداد العينات
ملاحظة: كمية البدء النموذجية ل PIB-MS هي 1 ملغ من البروتين الكلي لكل حالة. في هذه التجربة ، تم استخ?...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS هو نهج بروتينات كيميائية يستخدم لتحديد ملامح PPPome كميا من مصادر عينة مختلفة في تحليل واحد. تم القيام بالكثير من العمل باستخدام حبات مثبطات كيناز لدراسة الكينوم وكيف يتغير في السرطان والحالات المرضية الأخرى10،11،12،13. ...

تتحكم فسفرة البروتين في معظم العمليات الخلوية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاستجابة لتلف الحمض النووي ، وإشارات عامل النمو ، والمرور عبر الانقسام1،2،3. في خلايا الثدييات ، يتم فسفوريلات غالبية البروتينات في واحد أو أكثر من بقايا سيرين أو ثريونين أو التيروزين في وقت ما ، مع فوسفوسرين وفوسفوثريونين يشكلون حوالي 98 ٪ من جميع مواقع الفسفرة 2,3. في حين تمت دراسة الكينازات على نطاق واسع في الإشارات الخلوية ، فإن دور الشراكات بين القطاعين العام والخاص في تنظيم العمليات الخلوية الديناميكية لا يزال ناشئا.
يتم التحكم في ديناميكيات الفسفرة من خلال التفاعل الديناميكي بين الكينازات والفوسفاتيز. في خلايا الثدييات ، هناك أكثر من 400 كيناز بروتين يحفز فسفرة سيرين / ثريونين. أكثر من 90٪ من هذه المواقع يتم نزع الفوسفوريلات بواسطة فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتيني (PPPs) ، وهي عائلة صغيرة من الإنزيمات التي تتكون من PP1 و PP2A و PP2B و PP4-7 و PPT و PPZ 2,3. PP1 و PP2A مسؤولان عن غالبية إزالة الفوسفوسرين والفوسفوثريونين داخل الخلية2،3،4. أدى الاختلاف الملحوظ في العدد بين الكينازات والفوسفاتيز وعدم خصوصية الوحدات الفرعية الحفازة PPP في المختبر إلى الاعتقاد بأن الكينازات هي المحدد الرئيسي للفسفرة 2,3. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسات متعددة أن الفوسفاتيز يؤسس خصوصية الركيزة من خلال تكوين إنزيمات هولو متعددة الميريك5،6،7،8،9. على سبيل المثال ، PP1 هو غير متجانس يتكون من وحدة فرعية حفازة ، وفي وقت معين ، واحد من أكثر من 150 وحدة فرعية تنظيمية 6,7,8. على العكس من ذلك ، PP2A هو متغاير يتكون من سقالات (A) ، ووحدة تنظيمية (B) ، ووحدة فرعية حفازة (C) 2,3,9. هناك أربع عائلات متميزة من الوحدات الفرعية التنظيمية PP2A (B55 و B56 و PR72 و striatin) ، لكل منها جينات متعددة ، ومتغيرات الربط ، وأنماط التوطين2،3،9. وتسد الطبيعة المتعددة للشراكات بين القطاعين العام والخاص الفجوة في عدد الكينازات والوحدات الفرعية الحفازة لتعادل القوة الشرائية. ومع ذلك ، فإنه يخلق تحديات تحليلية لدراسة إشارات الشراكة بين القطاعين العام والخاص. لتحليل إشارات PPP بشكل شامل ، من الأهمية بمكان التحقيق في مختلف الإنزيمات الهولونية داخل الخلية أو الأنسجة. تم إحراز تقدم كبير في دراسة الكينومي البشري من خلال استخدام حبات مثبطات الكيناز ، التي يطلق عليها اسم حبات مثبطات الإرسال المتعددة أو الخرز ، وهي استراتيجية بروتينية كيميائية حيث يتم تجميد مثبطات الكيناز على الخرز ويستخدم قياس الطيف الكتلي لتحديد الكينازات المخصبة وتفاعلها10،11،12،13.
لقد أنشأنا نهجا مشابها لدراسة بيولوجيا الشراكة بين القطاعين العام والخاص. تتضمن هذه التقنية التقاط التقارب للوحدات الفرعية الحفازة PPP باستخدام الخرز مع مثبط PPP غير انتقائي غير متحرك يسمى microcystin-LR (MCLR) يسمى حبات مثبطات الفوسفاتيز (PIBs) 14,15. على عكس الطرق الأخرى التي تتطلب وضع علامات داخلية أو التعبير عن الوحدات الفرعية لتعادل القوة الشرائية الخارجية التي يمكن أن تغير نشاط البروتين أو توطينه ، يسمح PIB-MS بإثراء الوحدات الفرعية المحفزة لتعادل القوة الشرائية الذاتية المنشأ ، والوحدات الفرعية التنظيمية والسقالات المرتبطة بها ، والبروتينات المتفاعلة (تسمى PPPome) من الخلايا والأنسجة في نقطة زمنية معينة أو في ظل ظروف علاج محددة. يمنع MCLR PP1 و PP2A و PP4-6 و PPT و PPZ بتركيزات نانومولية ، مما يجعل PIBs فعالة للغاية في إثراء PPPome16. يمكن تحجيم هذه الطريقة لاستخدامها على أي مادة أولية من الخلايا إلى العينات السريرية. هنا ، نصف بالتفصيل استخدام PIBs وقياس الطيف الكتلي (PIB-MS) لالتقاط وتحديد وقياس PPPome الداخلي وحالات تعديله بكفاءة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> الشكل 1: ملخص مرئي لبروتوكول PIB-MS. في تجربة PIB-MS ، يمكن الحصول على عينات بأشكال مختلفة ، من الخلايا إلى الأورام. يتم جمع العينة وتحليلها وتجانسها قبل إثراء تعادل القوة الشرائية. للإثراء من أجل الشراكات بين القطاعين العام والخاص، يتم احتضان الليزات مع PIBs مع أو بدون مثبط PPP، مثل MCLR. ثم يتم غسل PIBs ، ويتم التخلص من PPPs في ظروف تمسخ. يتم إعداد العينات لتحليل الطيف الكتلي عن طريق إزالة المنظفات من خلال إثراء البروتين SP3 ، والهضم التربتيكي ، وإزالة الملح. يمكن بعد ذلك وضع علامة TMT اختياريا على العينات قبل تحليل مطياف الكتلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتضمن PIB-MS تحلل وتوضيح الخلايا أو الأنسجة ، وحضانة الليزات باستخدام PIBs ، والاستخلاص ، وتحليل اللوات عبر النشاف الغربي أو النهج القائمة على قياس الطيف الكتلي (الشكل 1). يمكن استخدام إضافة MCLR المجاني كعنصر تحكم لتمييز روابط PIB المحددة عن الجهات الفاعلة غير المحددة. بالنسبة لمعظم التطبيقات ، يمكن استخدام نهج خال من الملصقات لتحديد البروتينات مباشرة في المراوغة. وفي الحالات التي تكون فيها هناك حاجة إلى مزيد من الدقة في التحديد الكمي أو تحديد الأنواع منخفضة الوفرة، يمكن استخدام مزيد من المعالجة باستخدام وسم العلامات الجماعية الترادفية (TMT) لزيادة التغطية وتقليل المدخلات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

يتم تنظيم معظم العمليات الخلوية عن طريق فسفرة البروتين الديناميكية. أكثر من ثلاثة أرباع البروتينات مفسفرة ، وفوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتيني (PPPs) تنسق أكثر من 90٪ من جميع عمليات إزالة الفوسفور الخلوية من السيرين / الثريونين. وقد تورط تحرير فسفرة البروتين في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والتنكس العصبي. وعلى الرغم من نشاطها الواسع النطاق، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في الشراكات بين القطاعين العام والخاص وتلك التي تسيطر عليها الشراكات بين القطاعين العام والخاص لا تتسم بخصائص كافية. هنا ، يتم وصف نهج بروتيني يسمى حبات مثبطات الفوسفاتيز وقياس الطيف الكتلي (PIB-MS) لتحديد وقياس PPPs ، وتعديلاتها بعد الترجمة ، ومفاعلاتها المتفاعلة في أقل من 12 ساعة باستخدام أي خط خلية أو أنسجة. يستخدم PIB-MS مثبطا غير انتقائي لتعادل القوة الشرائية ، microcystin-LR (MCLR) ، مثبتا على حبات السيفاروز لالتقاط وإثراء PPPpps الذاتية المنشأ والبروتينات المرتبطة بها (تسمى PPPome). لا تتطلب هذه الطريقة التعبير الخارجي للإصدارات الموسومة من PPPs أو استخدام أجسام مضادة محددة. يقدم PIB-MS طريقة مبتكرة لدراسة الشراكات بين القطاعين العام والخاص المحفوظة تطوريا وتوسيع فهمنا الحالي لإشارات إزالة الفسفرة.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> الشكل 2: تحديد روابط PIBs محددة . (أ) يمكن تحليل مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة أو الخلايا عبر PIB-MS. تمت معالجة خلايا HeLa في الثلاثي البيولوجي إما باستخدام DMSO أو MCLR المثبط ل PPP ، وت...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

هنا ، نقدم بروتوكولا لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين الداخلي المنشأ وبروتيناتها المتفاعلة من الخلايا والأنسجة وتحديدها وتحديدها كميا بواسطة البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي.

نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS هي تقنية جديدة تستخدم لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوري الداخلي المنشأ وهي تتفاعل مع البروتينات من الخلايا والأنسجة. وهو ينطوي على تحديد هذه البروتينات وتحديدها كميا باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي. لا تتطلب هذه التقنية التعبير الخارجي عن الإصدارات الموسومة من فوسفاتيز البروتين الفوسفوري التي يمكن أن تغير نشاط البروتين أو توطينه.أيضا ، لا يستخدم الأجسام المضادة التي قد تكون غير محددة أو غير قادرة على التمييز بين أشكال متساوية محددة. يمكن تحجيم هذه الطريقة للتحقيق في PPPM لاستخدامها في كل شيء من الخلايا إلى العينات السريرية. للبدء ، اجمع حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 277 مرة جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.إزالة الوسائط وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من PBS. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل كما هو موضح في بروتوكول النص واحتفظ به على الجليد. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل المبرد إلى العينات ، ثم قم بتجانس العينات عن طريق الرنين واحتفظ بالخلايا على الجليد بين البقوليات.انقل الليزات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر جديدة. الطرد المركزي للعينة الصوتية عند 21 ، 130 مرة غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخدم أليكوت من الليزات لقياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك.هذه الخطوة ضرورية لضمان تركيز متساو للبروتين في كل عينة. للتحكم في مثبطات فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتيني ، قم بإعداد اثنين من الأليكوت بتركيز متساو للبروتين لكل عينة. يمكن استخدام المخزن المؤقت للتحلل لتخفيف العينات بحيث يكون لكل أنبوب تركيز متساو من البروتين.أضف ميكرومولار واحد من microcystin-LR المجاني إلى أليكوت واحد وحجم متساو من DMSO إلى الآخر. دوامة العينات واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. يجب أن يتم تحضير حبات مثبطات الفوسفاتيز في وقت مبكر أو أثناء خطوات الحضانة الموضحة في قسم إعداد العينة.استخدم 10 ميكرولترات من حبات مثبطات الفوسفاتيز الصلبة ، أو راتنج PIB ، للحصول على ملليغرام واحد من البروتين وأضفها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. اغسل PIBs ثلاث مرات باستخدام 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل عن طريق الدوامة تليها الطرد المركزي عند 376 مرة جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحلل إلى PIBs المغسولة لإنشاء محلول مخزن مؤقت PIB بنسبة 50٪ حسب الحجم.اخلطي عن طريق سحب طرف الماصة والطين بلطف وقم بتدوير طرف الماصة والملاط لإعادة تعليق PIBs. انقل 20 ميكرولتر من الملاط إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحليل. قم بتدوير الأنابيب بسرعة 376 مرة جم لمدة 30 ثانية.يحتوي كل أنبوب على كميات متساوية من PIBs فيه. تخلص من السوبرناتانت مع ترك الراتنج الصلب فقط وما يصل إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل في كل أنبوب. انقل الليزات إلى الأنابيب ذات العلامات المناسبة التي تحتوي على PIBs.احتضن الليزات مع PIBs لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 8 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة مع lysate ، قم بالطرد المركزي ل PIBs عند 376 مرة g لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل الخرز بإضافة 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل وعكس الأنابيب جمع الخرز عن طريق الطرد المركزي وإزالة السوبرناتانت.كرر هذه الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة مخزن التحلل المؤقت قدر الإمكان دون سحب PIBs. قم بإعداد مخزن مؤقت للإزالة يحتوي على 2٪ SDS وأضف المخزن المؤقت للإزالة أربعة إلى خمسة أضعاف حجم PIBs.احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتلويح فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين من الخرز. قم بطرد الأنابيب مركزيا بسرعة 376 مرة جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. اجمع اللوات في أنبوب منفصل وتابع تحليلات قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي.لتجديد PIBs ، احتضنها في محلول SDS بنسبة 2٪ مع الدوران عند 8 دورات في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرز ثلاث إلى خمس مرات في 25 ملليمولار Tris-HCl pH 7.5 مع الدوران لمدة 30 دقيقة لكل غسلة. تخزين PIBs في 25 ملليمولار تريس HCL الرقم الهيدروجيني 7.5 مع أزيد الصوديوم.بالنسبة لتحليل الطيف الكتلي ، تختلف طرق تصفية البيانات وتحليلها ويمكن أن يقوم بها الباحث أو منشأة أساسية. بعد البحث في البيانات الخام مقابل قاعدة بيانات بروتيوم خاصة بالأنواع، قم بتصفية نتائج البحث وتصديرها كورقة عمل Microsoft Excel. تحليل البيانات في ثلاثة أضعاف.للقياس الكمي الخالي من التسميات، استخدم قياسات منطقة الذروة MS1 لتحديد كمية البيانات. لتحديد الوحدات الفرعية PPP ومتفاعلاتها من جديد ، قارن بين الثلاثية البيولوجية للعينات المثبطة للميكروسيستين - LR والعينات المعالجة ب DMSO. قم بتصفية البيانات بحيث لا يوجد سوى البروتينات التي يزيد إجمالي عدد الببتيد فيها عن واحد في عينتين على الأقل من العينات الثلاث المعالجة بالتحكم في DMSO.لتصفية البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالراتنج ، قم بإزالة البروتينات التي يكون فيها إجمالي عدد الببتيد في الحالة المعالجة بالميكروسيستين LR أعلى من أي وحدة فرعية حفازة PPP. استبعاد الملوثات الشائعة مثل الكيراتين والكولاجين والبروتينات الريبوسومية والبروتينات النووية النووية غير المتجانسة من التحليل. يعد ملف CSV ضروريا لاستيراد البيانات إلى Perseus.استيراد البيانات التي تمت تصفيتها إلى Perseus بالنقر فوق تحميل مصفوفة عامة في قسم تحميل. قم بتحويل البيانات بالانتقال إلى التحويل الأساسي وتحديد البيانات وتحديد دالة التحويل كقاعدة سجل 2 من x. قم بإسناد القيم المفقودة من توزيع عادي بالانتقال إلى الإسناد، واستبدل القيم المفقودة من التوزيع العادي، وحدد البيانات وحدد العرض وإزاحة الأسفل للحساب.قم بإجراء التطبيع الكمي من خلال الانتقال إلى التطبيع الكمي. أضف تعليقات توضيحية على البيانات بالانتقال إلى صفوف Annot، صفوف التعليقات التوضيحية الفئوية. قم بإجراء اختبار T للطالب من خلال الانتقال إلى الاختبارات ، والاختبارات المكونة من عينتين ، وتحديد المجموعات ، والاختبار المطلوب إجراؤه ، وطريقة تصحيح اختبار الفرضيات المتعددة كما هو مستخدم في الاقتطاع.تقوم هذه الدالة أيضا بحساب نسب السجل 2. تم تحديد فوسفوتات البروتين الفوسفوبروتين والجهات الفاعلة البينية الخاصة بها في خلايا HeLa باستخدام تجربة سحب PIB ، تليها تحديد كمي خال من الملصقات لوفرة البروتين في العينات المعالجة ب DMSO و microcystin-LR. حددت مخطط بركان لتحليل الطيف الكتلي روابط PIB محددة تظهر باللون الأحمر ، ووحدات فرعية حفازة باللون الأزرق ، ووحدات فرعية مرشحة جديدة ل PPP ، أو البروتينات المتفاعلة ، باللون الأبيض.تم عرض المجلدات غير المحددة باللون الرمادي. وأظهرت القطعة المبعثرة لمنطقة log2 من محللة خلايا HeLa المعالجة ب DMSO أن الوفرة كانت مترابطة إلى حد كبير، مما يشير إلى إمكانية تكرار البيانات. أظهر تحليل الشبكة لجميع الوحدات الفرعية فوسفاتيز البروتين الفوسفوري والبروتينات المتفاعلة أن هذه البروتينات كانت مفاعلات متفاعلة محددة في سحب PIB.ويمكن إجراء تحليلات عالمية للبروتينات ومقارنة النتائج بتحليل PIB لتحديد ما إذا كان تكوين PPPome مدفوعا بوفرة تعادل القوة الشرائية أو تنظمه آليات ما بعد الترجمة. PIB-MS هي أداة قابلة للتطبيق على نطاق واسع سمحت لنا بتحديد الاختلافات في أنماط التعبير PPP في ظل ظروف مختلفة مثل العينات البينية مقابل العينات الانقسامية أو الاختلافات بين خطوط الخلايا السرطانية.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

منصة Seq الميثيل الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...