Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. anerkender støtte fra NIH R33 CA225458 og R35 GM119455. Vi takker Kettenbach- og Gerber-laboratorierne for deres nyttige diskussion.

BEMÆRK: Genereringen af PIB'er udføres som beskrevet af Moorhead et al., hvor 1 mg mikrocystin og ca. 6 ml sepharose er koblet til at generere PIBs med en bindingskapacitet på op til 5 mg / ml17.
1. Forberedelse af prøve
BEMÆRK: En typisk udgangsmængde for PIB-MS er 1 mg totalt protein pr. tilstand. Til dette forsøg blev ca. 2,5 x 106 HeLa-celler brugt til at ekstrahere 1 mg protein. Denne beregning skal udfø...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS er en kemisk proteomics-tilgang, der bruges til kvantitativt at profilere PPPome fra forskellige prøvekilder i en enkelt analyse. Meget arbejde er blevet gjort ved hjælp af kinasehæmmerperler til at studere kinomet og hvordan det ændrer sig i kræft og andre sygdomstilstande 10,11,12,13. Alligevel halter undersøgelsen af PPPome bagud. Vi forventer, at denne tilgang er i stand til at...

Proteinfosforylering styrer de fleste cellulære processer, herunder men ikke begrænset til reaktionen på DNA-skader, vækstfaktorsignalering og passage gennem mitose 1,2,3. I pattedyrceller phosphoryleres størstedelen af proteinerne ved en eller flere serin-, threonin- eller tyrosinrester på et eller andet tidspunkt, hvor fosfosiner og fosfothrenoner udgør ca. 98% af alle phosphoryleringssteder 2,3. Mens kinaser er blevet grundigt undersøgt i cellulær signalering, er PPP'ernes rolle i reguleringen af dynamiske cellulære processer stadig ved at dukke op.
Fosforyleringsdynamik styres af det dynamiske samspil mellem kinaser og fosfataser. I pattedyrceller er der mere end 400 proteinkinaser, der katalyserer serin / threonin phosphorylering. Over 90% af disse steder dephosphoryleres af phosphoproteinphosphataser (PPP'er), en lille familie af enzymer, der består af PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT og PPZ 2,3. PP1 og PP2A er ansvarlige for størstedelen af fosphoserin- og phosfothreonin-dephosphorylation i en celle 2,3,4. Den bemærkelsesværdige forskel i antal mellem kinaser og fosfataser og manglen på specificitet af PPP-katalytiske underenheder in vitro førte til troen på, at kinaser er den vigtigste determinant for phosphorylering 2,3. Imidlertid har flere undersøgelser vist fosfataser at etablere substratspecificitet gennem dannelsen af multimere holoenzymer 5,6,7,8,9. For eksempel er PP1 en heterodimer, der består af en katalytisk underenhed og på et givet tidspunkt en ud af de mere end 150 regulatoriske underenheder 6,7,8. Omvendt er PP2A en heterotrimer, der er dannet af et stillads (A), en regulatorisk (B) og en katalytisk (C) underenhed 2,3,9. Der er fire forskellige familier af PP2A-regulatoriske underenheder (B55, B56, PR72 og striatin), hver med flere gener, splejsningsvarianter og lokaliseringsmønstre 2,3,9. PPP'ernes multimere karakter udfylder hullet i antallet af kinaser og PPP-katalytiske underenheder. Det skaber dog analytiske udfordringer for at studere OPP-signalering. For omfattende at analysere PPP-signalering er det afgørende at undersøge de forskellige holoenzymer i en celle eller et væv. Der er gjort store fremskridt med at studere det humane kinom ved hjælp af kinasehæmmerperler, kaldet multiplexhæmmerperler eller kinobeader, en kemisk proteomisk strategi, hvor kinasehæmmere immobiliseres på perler, og massespektrometri bruges til at identificere berigede kinaser og deres interagerere 10,11,12,13.
Vi har etableret en lignende tilgang til at studere PPP biologi. Denne teknik involverer affinitetsindfangning af PPP-katalytiske underenheder ved anvendelse af perler med en immobiliseret, ikke-selektiv PPP-hæmmer kaldet microcystin-LR (MCLR) kaldet phosphatasehæmmerperler (PIBs)14,15. I modsætning til andre metoder, der kræver endogen mærkning eller ekspression af eksogene PPP-underenheder, der kan ændre proteinaktivitet eller lokalisering, giver PIB-MS mulighed for berigelse af endogene PPP-katalytiske underenheder, deres tilknyttede regulatoriske og stilladsunderenheder og interagerende proteiner (kaldet PPPome) fra celler og væv på et givet tidspunkt eller under specifikke behandlingsbetingelser. MCLR hæmmer PP1, PP2A, PP4-6, PPT og PPZ i nanomolære koncentrationer, hvilket gør PIB'er yderst effektive til berigelse for PPPome16. Denne metode kan skaleres til brug på ethvert udgangsmateriale fra celler til kliniske prøver. Her beskriver vi detaljeret brugen af PIB'er og massespektrometri (PIB-MS) til effektivt at fange, identificere og kvantificere det endogene PPPome og dets modifikationstilstande.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figur 1: Visuel oversigt over PIB-MS-protokollen. I et PIB-MS-eksperiment kan prøver opnås i forskellige former, fra celler til tumorer. Prøven opsamles, lyses og homogeniseres inden PPP-berigelse. For at berige for PPP'er inkuberes lysatet med PIB'er med eller uden en PPP-hæmmer, såsom MCLR. POB'erne vaskes derefter, og OPP'er elueres under denatureringsforhold. Prøverne fremstilles til massespektrometrianalyse ved fjernelse af vaskemidler gennem SP3-proteinberigelse, tryptisk fordøjelse og afsaltning. Prøver kan derefter valgfrit TMT-mærkes inden massespektrometrianalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
PIB-MS involverer lysis og afklaring af celler eller væv, inkubation af lysatet med PIB'er, eluering og analyse af eluatet via western blotting eller massespektrometribaserede tilgange (figur 1). Tilføjelsen af gratis MCLR kan bruges som en kontrol til at skelne specifikke PIB-bindemidler fra ikke-specifikke interagerere. Til de fleste applikationer kan en etiketfri tilgang bruges til direkte at identificere proteiner i eluater. I tilfælde, hvor der er behov for større præcision i kvantificeringen eller identifikationen af arter med lav forekomst, kan yderligere behandling med tandemmassemærkemærkning (TMT) anvendes til at øge dækningen og mindske inputtet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

De fleste cellulære processer reguleres af dynamisk proteinfosforylering. Mere end tre fjerdedele af proteinerne phosphoryleres, og phosphoproteinphosphataser (PPP'er) koordinerer over 90% af al cellulær serin / threonin dephosphorylation. Deregulering af proteinfosforylering har været impliceret i patofysiologien af forskellige sygdomme, herunder kræft og neurodegeneration. På trods af deres udbredte aktivitet er de molekylære mekanismer, der styrer PPP'er, og dem, der kontrolleres af PPP'er, dårligt karakteriseret. Her beskrives en proteomisk tilgang kaldet phosphatasehæmmerperler og massespektrometri (PIB-MS) for at identificere og kvantificere PPP'er, deres posttranslationelle modifikationer og deres interagerer på så lidt som 12 timer ved hjælp af en hvilken som helst cellelinje eller væv. PIB-MS anvender en ikke-selektiv PPP-hæmmer, microcystin-LR (MCLR), immobiliseret på sepharose perler til at fange og berige endogene PPP'er og deres tilknyttede proteiner (kaldet PPPome). Denne metode kræver ikke eksogen ekspression af mærkede versioner af PPP'er eller anvendelse af specifikke antistoffer. PIB-MS tilbyder en innovativ måde at studere de evolutionært bevarede PPP'er og udvide vores nuværende forståelse af dephosphorylationssignalering.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figur 2: Identifikation af specifikke PIBs-bindemidler. (A) En række vævstyper eller celler kan analyseres via PIB-MS. HeLa-celler i biologisk tredobling blev enten behandlet med DMSO eller PPP-hæmmeren MCLR, inkuberet med PIB'er og analyseret via LC-MS/MS. (B) Vulkandiagram over PIB-MS-anal...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Her præsenterer vi en protokol til berigelse af endogene phosphoproteinphosphataser og deres interagerende proteiner fra celler og væv og deres identifikation og kvantificering ved massespektrometribaseret proteomik.

En massespektrometribaseret tilgang til identifikation af fosfoproteinphosphataser og deres interaktionorer

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS er en ny teknik, der bruges til at berige for endogene fosforproteinphosphataser, og de interagerer proteiner fra celler og væv. Det indebærer identifikation og kvantificering af disse proteiner ved hjælp af massespektrometribaseret proteomics. Denne teknik kræver ikke eksogen ekspression af mærkede versioner af phosphorproteinphosphataser, der kan ændre proteinaktivitet eller lokalisering.Det bruger heller ikke antistoffer, der muligvis ikke er specifikke eller ude af stand til at skelne mellem specifikke isoformer. Denne metode til undersøgelse af PPPM kan skaleres til brug på alt fra celler til kliniske prøver. Til at begynde med opsamles cellepellet ved centrifugering ved 277 gange g i to minutter ved stuetemperatur.Fjern medier og vask cellerne med fem milliliter PBS. Forbered lysisbuffer som beskrevet i tekstprotokollen og hold den på is. Tilsæt en milliliter kølet lysisbuffer til prøverne, homogeniser derefter prøverne ved sonificering og hold cellerne på is mellem pulser.Overfør lysaterne til friske 1,5 ml rør. Centrifuger den sonikerede prøve ved 21,130 gange g i 15 minutter ved 4 grader Celsius. Brug en aliquot af lysatet til at kvantificere den samlede proteinkoncentration ved hjælp af et bicinchoninsyreassay.Dette trin er vigtigt for at sikre lige proteinkoncentration i hver prøve. Til en phosphoproteinphosphatasehæmmerkontrol skal der fremstilles to alikvoter med samme proteinkoncentration for hver prøve. Lysisbuffer kan bruges til at fortynde prøverne, så hvert rør har samme proteinkoncentration.Tilsæt en mikromolar af fri mikrocystin-LR til en aliquot og et lige stort volumen DMSO til den anden. Vortex prøverne og inkuber dem på is i 15 minutter. Fremstillingen af fosfatasehæmmerperlerne skal udføres på forhånd eller under de inkubationstrin, der er beskrevet i afsnittet om prøveforberedelse.Brug 10 mikroliter af faste phosphatasehæmmerperler eller PIB-harpiks til et milligram protein og tilsæt dem til et 1,5 ml rør. PIB'erne vaskes tre gange med 0,5 ml lysisbuffer ved hvirveldannelse efterfulgt af centrifugering ved 376 gange g i 30 sekunder ved stuetemperatur. Tilsæt en passende mængde lysisbuffer til de vaskede PIB'er for at fremstille PIB-bufferopløsningen på 50 volumenprocent.Bland forsigtigt ved pipettering og hvirvle pipettespidsen og gyllen for at resuspendere PIB'erne. Overfør 20 mikroliter af gyllen til et 1,5 ml rør indeholdende 0,5 ml lysisbuffer. Drej rørene ved 376 gange g i 30 sekunder.Hvert rør indeholder lige store mængder PIBs i det. Supernatanten kasseres, mens der kun efterlades den faste harpiks og op til 50 mikroliter lysisbuffer i hvert rør. Lysaterne overføres til de passende mærkede rør, der indeholder PIBs.Inkubere lysatet med PIB'erne i en time ved 4 grader Celsius med rotation ved 8 o / min. Efter inkubation med lysatet centrifugeres PIB'erne ved 376 gange g i 30 sekunder ved 4 grader Celsius og supernatanten fjernes. Vask perlerne ved at tilsætte 0,5 ml lysisbuffer og invertere rørene Saml perlerne ved centrifugering og fjern supernatanten.Gentag dette trin for i alt tre vaske. Efter den sidste vask skal du fjerne lysisbufferen så meget som muligt uden at pipettere PIB'erne. Forbered elueringsbuffer indeholdende 2% SDS, og tilsæt elueringsbufferen fire til fem gange volumenet af PIB'er.Inkuberes ved 65 grader Celsius i en time for at eluere fosfoproteinphosphataserne fra perlerne. Rørene centrifugeres ved 376 gange g i 30 sekunder ved stuetemperatur. Eluatet opsamles i et separat rør, og der foretages massespektrometrianalyser eller western blotting.For at regenerere PIB'erne inkuberes de i 2% SDS-opløsning med rotation ved 8 o / min i en time ved stuetemperatur. Perlerne vaskes tre til fem gange i 25 millimolar Tris-HCl pH 7,5 med rotation i 30 minutter pr. vask. Opbevar PIB'er i 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 med natriumazid.Til massespektrometrianalyse varierer metoder til datafiltrering og analyse og kan udføres af forskeren eller en kernefacilitet. Når du har søgt i rådata mod en artsspecifik proteomdatabase, skal du filtrere søgeresultaterne og eksportere dem som et Microsoft Excel-regneark. Analyser dataene i tre eksemplarer.Til mærkningsfri kvantificering skal du bruge MS1-spidsarealmålinger til at kvantificere dataene. For at identificere PPP-underenheder og deres interactorer de novo skal du sammenligne biologiske triplikater af mikrocystin-LR-hæmmede og DMSO-behandlede prøver. Filtrer dataene, så kun proteiner med et samlet peptidantal på mere end en ud af mindst to af de tre DMSO-kontrolbehandlede prøver er til stede.For at filtrere proteiner, der ikke specifikt binder til harpiksen, skal du fjerne proteinerne, hvor det samlede peptidantal i den mikrocystin-LR-behandlede tilstand er højere end for enhver PPP-katalytisk underenhed. Ekskluder almindelige forurenende stoffer såsom keratin, kollagen, ribosomale proteiner og heterogene nukleare ribonukleoproteiner fra analysen. En CSV-fil er afgørende for at importere dataene til Perseus.Importer filtrerede data til Perseus ved at klikke på Generisk matrixoverførsel i afsnittet Indlæs. Transformér dataene ved at gå til Grundlæggende transformering, vælge dataene og angive transformationsfunktionen som logbase 2 af x. Imputer manglende værdier fra en normalfordeling ved at gå til Imputation, Erstat manglende værdier fra normalfordeling, vælg dataene og angiv bredden og nedforskydningen for beregningen.Udfør kvantil normalisering ved at gå til Normalisere, Kvantil normalisering. Kommenter dataene ved at gå til Annotrækker, Kategoriske annotationsrækker. Udfør elevens T-test ved at gå til tests, to-prøvetest, vælge grupperne, testen, der skal udføres, og metoden til korrektion af flere hypotesetest som brugt til afkortning.Denne funktion beregner også log 2-forholdet. Phosphoproteinphosphotater og deres interaktionorer blev identificeret i HeLa-cellerne ved hjælp af et PIB-pull-down-eksperiment efterfulgt af etiketfri kvantificering af proteinforekomst i DMSO-behandlede og mikrocystin-LR-behandlede prøver. Vulkanplot af massespektrometrianalyse identificerede specifikke PIB-bindemidler vist i røde, katalytiske underenheder i blåt og nye kandidat PPP-underenheder eller interagerende proteiner i hvidt.Ikke-specifikke ringbind blev vist i gråt. Scatter plot af log2 område fra det DMSO-behandlede HeLa celle lysat viste, at overfloden var stærkt korreleret, hvilket indikerer reproducerbarhed af dataene. Netværksanalyse af alle phosphorproteinphosphataseunderenheder og interagerende proteiner viste, at disse proteiner var specifikke interaktionorer i PIB-pull-down.Globale proteomics-analyser kunne udføres, og resultaterne kunne sammenlignes med PIB-analysen for at afgøre, om PPPome-sammensætningen er drevet af PPP-overflod eller reguleret af posttranslationelle mekanismer. PIB-MS er et bredt anvendeligt værktøj, der har gjort det muligt for os at identificere forskelle i PPP-ekspressionsmønstre under forskellige forhold såsom interfase versus mitotiske prøver eller forskelle mellem kræftcellelinjer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En rotte Methyl-Seq Platform til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med Stress eksponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Udnyttelse af grafix til påvisning af forbigående interactorer af saccharomyces cerevisiae splejsning splejsstoffer

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...