Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. erkent de steun van NIH R33 CA225458 en R35 GM119455. Wij danken de laboratoria van Kettenbach en Gerber voor hun nuttige discussie.

OPMERKING: De generatie van PIBs wordt gedaan zoals beschreven door Moorhead et al., waarbij 1 mg microcystine en ongeveer 6 ml sepharose worden gekoppeld om PIBs te genereren met een bindingscapaciteit van maximaal 5 mg / ml17.
1. Monstervoorbereiding
OPMERKING: Een typische starthoeveelheid voor PIB-MS is 1 mg totaal eiwit per aandoening. Voor dit experiment werden ongeveer 2,5 x 106 HeLa-cellen gebruikt om 1 mg ei...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS is een chemische proteomics-benadering die wordt gebruikt om het PPPome kwantitatief te profileren uit verschillende monsterbronnen in één analyse. Er is veel werk verricht met behulp van kinaseremmerkralen om het kinoom te bestuderen en hoe het verandert in kanker en andere ziektetoestanden 10,11,12,13. Toch blijft de studie van de PPPome achter. We verwachten dat deze aanpak in staat...

Eiwitfosforylering regelt de meeste cellulaire processen, inclusief maar niet beperkt tot de reactie op DNA-schade, groeifactorsignalering en de passage door mitose 1,2,3. In zoogdiercellen worden de meeste eiwitten op een bepaald moment gefosforyleerd op een of meer serine-, threonine- of tyrosineresiduen, waarbij fosfostropenen en fosfoothreonines ongeveer 98% van alle fosforyleringsplaatsen uitmaken 2,3. Hoewel kinasen uitgebreid zijn bestudeerd in cellulaire signalering, is de rol van PPP's in de regulatie van dynamische cellulaire processen nog steeds in opkomst.
Fosforyleringsdynamiek wordt gecontroleerd door het dynamische samenspel tussen kinasen en fosfatasen. In zoogdiercellen zijn er meer dan 400 eiwitkinasen die serine / threoninefosforylering katalyseren. Meer dan 90% van deze sites wordt gedefosforyleerd door fosfoproteïnefosfatasen (PPP's), een kleine familie van enzymen die bestaat uit PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT en PPZ 2,3. PP1 en PP2A zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van fosfosforrine en fosfotheonine defosforylering in een cel 2,3,4. Het opmerkelijke verschil in aantal tussen kinasen en fosfatasen en het gebrek aan specificiteit van PPP katalytische subeenheden in vitro leidden tot de overtuiging dat kinasen de belangrijkste determinant zijn van fosforylering 2,3. Meerdere studies hebben echter aangetoond dat fosfatasen substraatspecificiteit vaststellen door de vorming van multimere holo-enzymen 5,6,7,8,9. PP1 is bijvoorbeeld een heterodimeer dat bestaat uit een katalytische subeenheid en op een gegeven moment een van de meer dan 150 regulerende subeenheden 6,7,8. Omgekeerd is PP2A een heterotrimeer dat wordt gevormd uit een steiger (A), een regulerende (B) en een katalytische (C) subeenheid 2,3,9. Er zijn vier verschillende families van PP2A regulerende subeenheden (B55, B56, PR72 en striatine), elk met meerdere genen, splicevarianten en lokalisatiepatronen 2,3,9. Het multimere karakter van PPP's vult de leemte in het aantal kinasen en PPP-katalytische subeenheden. Het creëert echter analytische uitdagingen voor het bestuderen van PPP-signalering. Om PPP-signalering uitgebreid te analyseren, is het van cruciaal belang om de verschillende holo-enzymen in een cel of weefsel te onderzoeken. Er is grote vooruitgang geboekt bij het bestuderen van het menselijke kinoom door het gebruik van kinaseremmerparels, multiplexremmerparels of kinobeads genoemd, een chemische proteomische strategie waarbij kinaseremmers worden geïmmobiliseerd op kralen en massaspectrometrie wordt gebruikt om verrijkte kinasen en hun interactoren te identificeren 10,11,12,13.
We hebben een vergelijkbare aanpak vastgesteld om PPP-biologie te bestuderen. Deze techniek omvat affiniteitsvangst van PPP-katalytische subeenheden met behulp van kralen met een geïmmobiliseerde, niet-selectieve PPP-remmer genaamd microcystine-LR (MCLR) genaamd fosfataseremmerparels (PIBs)14,15. In tegenstelling tot andere methoden die de endogene tagging of expressie van exogene PPP-subeenheden vereisen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen, maakt PIB-MS de verrijking mogelijk van endogene PPP-katalytische subeenheden, hun bijbehorende regulerende en steigerende subeenheden en interagerende eiwitten (het PPPome genoemd) uit cellen en weefsels op een bepaald tijdstip of onder specifieke behandelingsomstandigheden. MCLR remt PP1, PP2A, PP4-6, PPT en PPZ bij nanomolaire concentraties, waardoor PIB's zeer effectief zijn in het verrijken voor de PPPome16. Deze methode kan worden geschaald voor gebruik op elk uitgangsmateriaal, van cellen tot klinische monsters. Hier beschrijven we in detail het gebruik van PIB's en massaspectrometrie (PIB-MS) om het endogene PPPome en de modificatietoestanden efficiënt vast te leggen, te identificeren en te kwantificeren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figuur 1: Visuele samenvatting van het PIB-MS protocol. In een PIB-MS-experiment kunnen monsters worden verkregen in verschillende vormen, van cellen tot tumoren. Het monster wordt verzameld, gelyseerd en gehomogeniseerd voorafgaand aan PPP-verrijking. Ter verrijking voor PPP's wordt het lysaat geïncubeerd met PIB's met of zonder PPP-remmer, zoals MCLR. De PIB's worden vervolgens gewassen en PPP's worden geëlueerd in denatureringsomstandigheden. De monsters worden voorbereid voor massaspectrometrie-analyse door de verwijdering van detergentia door sp3-eiwitverrijking, tryptische vertering en ontzouting. Monsters kunnen dan optioneel TMT-gelabeld worden voorafgaand aan massaspectrometrie analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
PIB-MS omvat lysis en klaring van cellen of weefsels, incubatie van het lysaat met PIBs, elutie en analyse van het eluaat via western blotting of op massaspectrometrie gebaseerde benaderingen (figuur 1). De toevoeging van vrije MCLR kan worden gebruikt als een controle om specifieke PIB-bindmiddelen te onderscheiden van niet-specifieke interactoren. Voor de meeste toepassingen kan een labelvrije aanpak worden gebruikt om eiwitten in eluaten direct te identificeren. In gevallen waarin een grotere precisie in kwantificering of de identificatie van soorten met een lage abundantie nodig is, kan verdere verwerking met tandem mass-tag (TMT) -etikettering worden gebruikt om de dekking te vergroten en de input te verminderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

De meeste cellulaire processen worden gereguleerd door dynamische eiwitfosforylering. Meer dan driekwart van de eiwitten is gefosforyleerd en fosfoproteïnefosfatasen (PPP's) coördineren meer dan 90% van alle cellulaire serine / threonine-defosforylering. Deregulering van eiwitfosforylering is betrokken bij de pathofysiologie van verschillende ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratie. Ondanks hun wijdverspreide activiteit zijn de moleculaire mechanismen die PPP's beheersen en die gecontroleerd door PPP's slecht gekarakteriseerd. Hier wordt een proteomische benadering beschreven die fosfataseremmerparels en massaspectrometrie (PIB-MS) wordt genoemd om PPP's, hun posttranslationele modificaties en hun interactoren in slechts 12 uur te identificeren en te kwantificeren met behulp van een cellijn of weefsel. PIB-MS maakt gebruik van een niet-selectieve PPP-remmer, microcystine-LR (MCLR), geïmmobiliseerd op sepharose-kralen om endogene PPP's en hun bijbehorende eiwitten te vangen en te verrijken (het PPPome genoemd). Deze methode vereist geen exogene expressie van gelabelde versies van PPP's of het gebruik van specifieke antilichamen. PIB-MS biedt een innovatieve manier om de evolutionair geconserveerde PPP's te bestuderen en ons huidige begrip van defosforyleringssignalering uit te breiden.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figuur 2: Identificatie van specifieke PIBs-bindmiddelen. (A) Een verscheidenheid aan weefseltypen of cellen kan worden geanalyseerd via PIB-MS. HeLa-cellen in biologisch triplicaat werden behandeld met DMSO of de PPP-remmer MCLR, geïncubeerd met PIB's, en geanalyseerd via LC-MS / MS. (B) Vulk...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS is een nieuwe techniek die wordt gebruikt om te verrijken voor endogene fosforproteïnefosfatasen en ze interageren eiwitten uit cellen en weefsels. Het gaat om de identificatie en kwantificering van deze eiwitten met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Deze techniek vereist niet de exogene expressie van gelabelde versies van fosforproteïnefosfatasen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen.Ook maakt het geen gebruik van antilichamen die mogelijk niet-specifiek zijn of niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen specifieke isovormen. Deze methode voor het onderzoeken van de PPPM kan worden geschaald voor gebruik op alles, van cellen tot klinische monsters. Verzamel om te beginnen celpellets door centrifugatie op 277 keer g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Verwijder media en was de cellen met vijf milliliter PBS. Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol en houd deze op ijs. Voeg een milliliter gekoelde lysisbuffer toe aan de monsters, homogeniseer vervolgens de monsters door sonificatie en houd de cellen op ijs tussen pulsen.Breng de lysaten over in verse buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer het gesonificeerde monster op 21, 130 maal g gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius. Gebruik een aliquot van het lysaat om de totale eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een bicinchonininezuurtest.Deze stap is essentieel om een gelijke eiwitconcentratie in elk monster te garanderen. Voor een fosfoproteïnefosfataseremmercontrole bereidt u twee aliquots van gelijke eiwitconcentratie voor elk monster. Lysisbuffer kan worden gebruikt om de monsters te verdunnen, zodat elke buis een gelijke eiwitconcentratie heeft.Voeg één micromolair vrij microcystine-LR toe aan het ene aliquot en een gelijk volume DMSO aan het andere. Vortex de monsters en incubeer ze op ijs gedurende 15 minuten. De bereiding van de fosfataseremmerparels moet van tevoren of tijdens de incubatiestappen worden uitgevoerd die in de monstervoorbereidingssectie worden beschreven.Gebruik 10 microliter vaste fosfataseremmers, of PIB-hars, voor één milligram eiwit en voeg ze toe aan een buis van 1,5 milliliter. Was de PIBs driemaal met 0,5 milliliter lysisbuffer door vortexing gevolgd door centrifugatie bij 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Voeg een geschikte hoeveelheid lysisbuffer toe aan de gewassen PIB's om een PIB-bufferoplossing van 50% per volume te maken.Meng door de pipetpunt en de slurry voorzichtig te pipetteren en te draaien om de PIB's te resuspenderen. Breng 20 microliter van de drijfmest over naar een buis van 1,5 milliliter met 0,5 milliliter lysisbuffer. Draai de buizen op 376 keer g gedurende 30 seconden.Elke buis bevat gelijke volumes PIBs erin. Gooi het supernatant weg terwijl alleen de vaste hars en maximaal 50 microliter lysisbuffer in elke buis blijven. Breng de lysaten over in de correct gelabelde buizen die PIB's bevatten.Incubeer het lysaat met de PIBs gedurende een uur bij 4 graden Celsius met rotatie bij 8 rpm. Na incubatie met het lysaat, centrifugeer de PIBs op 376 keer g gedurende 30 seconden bij 4 graden Celsius en verwijder het supernatant. Was de kralen door 0,5 milliliter lysisbuffer toe te voegen en de buisjes om te keren Verzamel de kralen door centrifugeren en verwijder het supernatant.Herhaal deze stap voor een totaal van drie wasbeurten. Verwijder na de laatste wasbeurt de lysisbuffer zoveel mogelijk zonder de PIB's te pipetteren. Bereid de elutiebuffer voor die 2% SDS bevat en voeg de elutiebuffer vier tot vijf keer het volume PIB's toe.Incubeer een uur bij 65 graden Celsius om de fosfoproteïnefosfatasen uit de kralen te elueren. Centrifugeer de buizen op 376 maal g gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verzamel het eluaat in een aparte buis en ga verder met massaspectrometrieanalyses of western blotting.Om de PIB's te regenereren, incubeer ze in 2% SDS-oplossing met rotatie bij 8 rpm gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de kralen drie tot vijf keer in 25 millimol Tris-HCl pH 7,5 met rotatie gedurende 30 minuten per wasbeurt. Bewaar PIBs in 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 met natriumazide.Voor massaspectrometrie-analyse variëren methoden voor gegevensfiltering en -analyse en kunnen deze worden uitgevoerd door de onderzoeker of een kernfaciliteit. Nadat u de onbewerkte gegevens hebt vergeleken met een soortspecifieke proteoomdatabase, filtert u de zoekresultaten en exporteert u deze als een Microsoft Excel-werkblad. Analyseer de gegevens in drievoud.Voor labelvrije kwantificering gebruikt u MS1-piekgebiedmetingen om de gegevens te kwantificeren. Om PPP-subeenheden en hun interactoren de novo te identificeren, vergelijkt u biologische triplicaten van microcystine-LR-geremde en DMSO-behandelde monsters. Filter de gegevens zodat alleen eiwitten met een totaal aantal peptiden van meer dan één op ten minste twee van de drie dmso-controlebehandelde monsters aanwezig zijn.Om eiwitten uit te filteren die niet-specifiek aan de hars binden, verwijdert u de eiwitten waarin het totale aantal peptiden in de met microcystine-LR behandelde toestand hoger is dan dat voor een PPP-katalytische subeenheid. Sluit veel voorkomende verontreinigingen zoals keratine, collageen, ribosomale eiwitten en heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen uit van de analyse. Een CSV-bestand is essentieel voor het importeren van de gegevens in Perseus.Importeer gefilterde gegevens in Perseus door te klikken op Algemene matrixupload in het gedeelte Laden. Transformeer de gegevens door naar Basistransformatie te gaan, de gegevens te selecteren en de transformatiefunctie op te geven als logboekbasis 2 van x. Reken ontbrekende waarden uit een normale verdeling toe door naar Imputatie te gaan, Ontbrekende waarden uit normale verdeling vervangen, de gegevens te selecteren en de breedte en het terugschakelen voor de berekening op te geven.Voer kwantielnormalisatie uit door naar Normaliseren, Kwantielnormalisatie te gaan. Annoteer de gegevens door naar Annot-rijen, Categorische annotatierijen te gaan. Voer de T-test van de student uit door naar Tests, Twee-steekproeftests te gaan, de groepen te selecteren, de uit te voeren test en de methode voor correctie van meerdere hypothesetests zoals gebruikt voor afkapping.Deze functie berekent ook de log 2-verhoudingen. Fosfoproteïnefosfaotaten en hun interactoren werden geïdentificeerd in de HeLa-cellen met behulp van een PIB pull-down experiment, gevolgd door labelvrije kwantificering van eiwitrijkdom in met DMSO behandelde en microcystine-LR-behandelde monsters. Vulkaanplot van massaspectrometrie-analyse identificeerde specifieke PIB-bindmiddelen weergegeven in rode, katalytische subeenheden in blauw en nieuwe kandidaat PPP-subeenheden, of interagerende eiwitten, in wit.Niet-specifieke bindmiddelen werden grijs weergegeven. Scatter plot van log2 gebied van de DMSO-behandelde HeLa cel lysaat toonde aan dat de abundanties sterk gecorreleerd waren, wat wijst op reproduceerbaarheid van de gegevens. Netwerkanalyse van alle fosforproteïnefosfatase-subeenheden en interagerende eiwitten toonde aan dat deze eiwitten specifieke interactoren waren in de PIB-pull-down.Globale proteomics-analyses kunnen worden uitgevoerd en de resultaten kunnen worden vergeleken met de PIB-analyse om te bepalen of de PPPome-samenstelling wordt aangedreven door PPP-abundantie of gereguleerd door posttranslationele mechanismen. PIB-MS is een breed toepasbaar hulpmiddel dat ons in staat heeft gesteld om verschillen in PPP-expressiepatronen onder verschillende omstandigheden te identificeren, zoals interfase versus mitotische monsters of verschillen tussen kankercellijnen.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...