Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. reconnaît le soutien des NIH R33 CA225458 et R35 GM119455. Nous remercions les laboratoires Kettenbach et Gerber pour leur discussion utile.

REMARQUE: La génération de PIB se fait comme décrit par Moorhead et al., où 1 mg de microcystine et environ 6 mL de sépharose sont couplés pour générer des PIBs avec une capacité de liaison allant jusqu’à 5 mg / mL17.
1. Préparation de l’échantillon
REMARQUE: Une quantité de départ typique pour PIB-MS est de 1 mg de protéines totales par condition. Pour cette expérience, environ 2,5 x 106 cellules...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS est une approche protéomique chimique utilisée pour profiler quantitativement le PPPome à partir de diverses sources d’échantillons en une seule analyse. Beaucoup de travail a été fait en utilisant des billes inhibitrices de kinase pour étudier le kinome et comment il change dans le cancer et d’autres états pathologiques 10,11,12,13. Pourtant, l’étude du PPPome est à la t...

La phosphorylation des protéines contrôle la plupart des processus cellulaires, y compris, mais sans s’y limiter, la réponse aux dommages à l’ADN, la signalisation du facteur de croissance et le passage par la mitose 1,2,3. Dans les cellules de mammifères, la majorité des protéines sont phosphorylées à un ou plusieurs résidus de sérine, de thréonine ou de tyrosine à un moment donné, les phosphosérines et les phosphothréonines représentant environ 98 % de tous les sites de phosphorylation 2,3. Alors que les kinases ont été largement étudiées dans la signalisation cellulaire, le rôle des PPP dans la régulation des processus cellulaires dynamiques est encore émergent.
La dynamique de phosphorylation est contrôlée par l’interaction dynamique entre les kinases et les phosphatases. Dans les cellules de mammifères, il existe plus de 400 protéines kinases qui catalysent la phosphorylation de la sérine/thréonine. Plus de 90% de ces sites sont déphosphorylés par les phosphoprotéines phosphatases (PPP), une petite famille d’enzymes composée de PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT et PPZ 2,3. PP1 et PP2A sont responsables de la majorité de la déphosphosérine et de la phosphothréonine dans une cellule 2,3,4. La différence notable de nombre entre les kinases et les phosphatases et le manque de spécificité des sous-unités catalytiques PPP in vitro ont conduit à la croyance que les kinases sont le principal déterminant de la phosphorylation 2,3. Cependant, de multiples études ont montré que les phosphatases établissaient la spécificité du substrat par la formation d’holoenzymes multimériques 5,6,7,8,9. Par exemple, PP1 est un hétérodimère constitué d’une sous-unité catalytique et, à un moment donné, d’une des plus de 150 sous-unités régulatrices 6,7,8. Inversement, PP2A est un hétérotrimère formé d’un échafaudage (A), d’une sous-unité régulatrice (B) et d’une sous-unité catalytique (C) 2,3,9. Il existe quatre familles distinctes de sous-unités régulatrices PP2A (B55, B56, PR72 et striatine), chacune avec plusieurs gènes, variantes d’épissure et modèles de localisation 2,3,9. La nature multimérique des PPP comble le manque de kinases et de sous-unités catalytiques PPP. Cependant, cela crée des défis analytiques pour l’étude de la signalisation PPP. Pour analyser de manière exhaustive la signalisation PPP, il est essentiel d’étudier les différentes holoenzymes au sein d’une cellule ou d’un tissu. De grands progrès ont été réalisés dans l’étude du kinome humain grâce à l’utilisation de perles inhibitrices de kinases, appelées perles inhibitrices multiplex ou kinobeads, une stratégie protéomique chimique où les inhibiteurs de kinases sont immobilisés sur des perles et où la spectrométrie de masse est utilisée pour identifier les kinases enrichies et leurs interacteurs 10,11,12,13.
Nous avons établi une approche similaire pour étudier la biologie des PPP. Cette technique implique la capture d’affinité de sous-unités catalytiques PPP à l’aide de billes avec un inhibiteur de PPP non sélectif immobilisé appelé microcystine-LR (MCLR) appelé billes inhibitrices de phosphatase (PIBs)14,15. Contrairement à d’autres méthodes qui nécessitent le marquage endogène ou l’expression de sous-unités PPP exogènes susceptibles de modifier l’activité ou la localisation des protéines, LE PIB-MS permet l’enrichissement des sous-unités catalytiques PPP endogènes, de leurs sous-unités régulatrices et d’échafaudage associées et des protéines en interaction (appelées PPPome) à partir de cellules et de tissus à un moment donné ou dans des conditions de traitement spécifiques. McLR inhibe PP1, PP2A, PP4-6, PPT et PPZ à des concentrations nanomolaires, ce qui rend les PIB très efficaces pour enrichir le PPPome16. Cette méthode peut être mise à l’échelle pour être utilisée sur n’importe quel matériau de départ, des cellules aux échantillons cliniques. Ici, nous décrivons en détail l’utilisation des PIB et de la spectrométrie de masse (PIB-MS) pour capturer, identifier et quantifier efficacement le PPPome endogène et ses états de modification.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figure 1 : Résumé visuel du protocole PIB-MS. Dans une expérience PIB-MS, des échantillons peuvent être obtenus sous diverses formes, des cellules aux tumeurs. L’échantillon est collecté, lysé et homogénéisé avant l’enrichissement en PPP. Pour enrichir les PPP, le lysat est incubé avec des PIB avec ou sans inhibiteur de PPP, tel que LE MCLR. Les PIB sont ensuite lavés et les PPP sont élués dans des conditions de dénaturation. Les échantillons sont préparés pour l’analyse par spectrométrie de masse par élimination des détergents par enrichissement en protéines SP3, digestion tryptique et dessalement. Les échantillons peuvent ensuite être éventuellement marqués TMT avant l’analyse par spectrométrie de masse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
PIB-MS implique la lyse et la clarification des cellules ou des tissus, l’incubation du lysat avec des PIB, l’élution et l’analyse de l’éluat via des approches basées sur le transfert occidental ou la spectrométrie de masse (Figure 1). L’ajout de MCLR libre peut être utilisé comme contrôle pour distinguer des liants PIB spécifiques des interacteurs non spécifiques. Pour la plupart des applications, une approche sans étiquette peut être utilisée pour identifier directement les protéines dans les éluats. Dans les cas où une plus grande précision dans la quantification ou l’identification des espèces de faible abondance est nécessaire, un traitement supplémentaire avec l’étiquetage en tandem masse-étiquette (TMT) peut être utilisé pour augmenter la couverture et diminuer les intrants.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

La plupart des processus cellulaires sont régulés par phosphorylation dynamique des protéines. Plus des trois quarts des protéines sont phosphorylées et les phosphoprotéines phosphatases (PPP) coordonnent plus de 90 % de toute la déphosphorylation cellulaire de la sérine/thréonine. La dérégulation de la phosphorylation des protéines a été impliquée dans la physiopathologie de diverses maladies, y compris le cancer et la neurodégénérescence. Malgré leur activité généralisée, les mécanismes moléculaires contrôlant les PPP et ceux contrôlés par les PPP sont mal caractérisés. Ici, une approche protéomique appelée perles inhibitrices de la phosphatase et spectrométrie de masse (PIB-MS) est décrite pour identifier et quantifier les PPP, leurs modifications post-traductionnelles et leurs interacteurs en aussi peu que 12 heures en utilisant n’importe quelle lignée cellulaire ou tissu. PIB-MS utilise un inhibiteur non sélectif du PPP, la microcystine-LR (MCLR), immobilisé sur des billes de sépharose pour capturer et enrichir les PPP endogènes et leurs protéines associées (appelées PPPome). Cette méthode ne nécessite pas l’expression exogène de versions marquées de PPP ni l’utilisation d’anticorps spécifiques. PIB-MS offre un moyen innovant d’étudier les PPP conservés de manière évolutive et d’élargir notre compréhension actuelle de la signalisation de déphosphorylation.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figure 2 : Identification de liants PIB spécifiques. (A) Divers types de tissus ou de cellules peuvent être analysés via PIB-MS. Les cellules HeLa en triplicate biologique ont été soit traitées avec du DMSO ou l’inhibiteur de PPP MCLR, incubées avec des PIBs, et analysées via LC-MS/MS. (B</str...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS est une nouvelle technique utilisée pour enrichir les phosphatases endogènes de phosphorprotéines et elles interagissent avec les protéines des cellules et des tissus. Il implique l’identification et la quantification de ces protéines à l’aide de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Cette technique ne nécessite pas l’expression exogène de versions marquées de phosphorprotéines phosphatases qui pourraient modifier l’activité ou la localisation des protéines.En outre, il n’utilise pas d’anticorps qui pourraient être non spécifiques ou incapables de distinguer entre des isoformes spécifiques. Cette méthode d’étude du PPPM peut être mise à l’échelle pour être utilisée sur tout, des cellules aux échantillons cliniques. Pour commencer, prélever la pastille cellulaire par centrifugation à 277 fois g pendant deux minutes à température ambiante.Retirez le support et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS. Préparez le tampon de lyse comme décrit dans le protocole de texte et restez sur la glace. Ajouter un millilitre de tampon de lyse réfrigéré aux échantillons, puis homogénéiser les échantillons par sonification et garder les cellules sur la glace entre les impulsions.Transférer les lysats dans des tubes frais de 1,5 millilitre. Centrifuger l’échantillon sonique à 21, 130 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Utilisez une aliquote du lysat pour quantifier la concentration totale en protéines à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique.Cette étape est essentielle pour assurer une concentration égale en protéines dans chaque échantillon. Pour un contrôle de l’inhibiteur de la phosphoprotéine phosphatase, préparer deux aliquotes de concentration égale en protéines pour chaque échantillon. Le tampon de lyse peut être utilisé pour diluer les échantillons afin que chaque tube ait une concentration de protéines égale.Ajouter un micromolaire de microcystine-LR libre à une aliquote et un volume égal de DMSO à l’autre. Vortex les échantillons et les incuber sur de la glace pendant 15 minutes. La préparation des billes d’inhibiteur de la phosphatase doit être effectuée à l’avance ou pendant les étapes d’incubation décrites dans la section de préparation de l’échantillon.Utilisez 10 microlitres de billes d’inhibiteurs de la phosphatase solide, ou résine PIB, pour un milligramme de protéine et ajoutez-les à un tube de 1,5 millilitre. Laver les PIB trois fois avec 0,5 millilitre de tampon de lyse par vortex suivi d’une centrifugation à 376 fois g pendant 30 secondes à température ambiante. Ajouter une quantité appropriée de tampon de lyse aux PIB lavés pour obtenir une solution tampon PIB de 50% en volume.Mélanger en pipetant doucement et faire tourbillonner l’embout de la pipette et la boue pour remettre en suspension les PIBs. Transférer 20 microlitres de la boue dans un tube de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de tampon de lyse. Faites tourner les tubes à 376 fois g pendant 30 secondes.Chaque tube contient des volumes égaux de PIB. Jetez le surnageant tout en ne laissant que la résine solide et jusqu’à 50 microlitres de tampon de lyse dans chaque tube. Transférer les lysats dans les tubes correctement étiquetés contenant des PIB.Incuber le lysat avec les PIBs pendant une heure à 4 degrés Celsius avec une rotation à 8 tr/min. Après incubation avec le lysat, centrifuger les PIB à 376 fois g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius et retirer le surnageant. Laver les billes en ajoutant 0,5 millilitre de tampon de lyse et en inversant les tubes Recueillir les billes par centrifugation et retirer le surnageant.Répétez cette étape pour un total de trois lavages. Après le lavage final, retirez le tampon de lyse autant que possible sans pipeter les PIB. Préparez un tampon d’élution contenant 2 % de FDS et ajoutez le tampon d’élution quatre à cinq fois le volume des PIB.Incuber à 65 degrés Celsius pendant une heure pour éluer les phosphoprotéines phosphatases des perles. Centrifugez les tubes à 376 fois g pendant 30 secondes à température ambiante. Recueillir l’éluat dans un tube séparé et procéder à des analyses de spectrométrie de masse ou à un transfert western.Pour régénérer les PIB, incubez-les dans une solution SDS à 2% avec rotation à 8 tr/min pendant une heure à température ambiante. Lavez les billes trois à cinq fois en Tris-HCl de 25 millimolaires pH 7,5 avec rotation pendant 30 minutes par lavage. Conservez les PIBs dans 25 millimolaires Tris HCL pH 7,5 avec de l’azoture de sodium.Pour l’analyse par spectrométrie de masse, les méthodes de filtrage et d’analyse des données varient et peuvent être effectuées par le chercheur ou une installation centrale. Après avoir recherché les données brutes dans une base de données de protéome spécifique à une espèce, filtrez les résultats de la recherche et exportez-les sous forme de feuille de calcul Microsoft Excel. Analysez les données en trois exemplaires.Pour une quantification sans étiquette, utilisez les mesures de la surface de crête MS1 pour quantifier les données. Pour identifier les sous-unités PPP et leurs interacteurs de novo, comparez les triples biologiques d’échantillons inhibés par la microcystine-LR et traités au DMSO. Filtrer les données de sorte que seules les protéines ayant un nombre total de peptides supérieur à un dans au moins deux des trois échantillons traités par contrôle du DMSO soient présentes.Pour filtrer les protéines qui ne se lient pas spécifiquement à la résine, éliminez les protéines dans lesquelles le nombre total de peptides dans l’état traité par microcystine-LR est plus élevé que celui de toute sous-unité catalytique PPP. Exclure de l’analyse les contaminants courants tels que la kératine, le collagène, les protéines ribosomiques et les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes. Un fichier CSV est essentiel pour importer les données dans Perseus.Importez les données filtrées dans Perseus en cliquant sur Téléchargement de matrice générique dans la section Charger. Transformez les données en accédant à Transformation de base, en sélectionnant les données et en spécifiant la fonction de transformation comme base de journal 2 de x. Imputer les valeurs manquantes d’une distribution normale en accédant à Imputation, Remplacer les valeurs manquantes de la distribution normale, en sélectionnant les données et en spécifiant la largeur et le décalage vers le bas pour le calcul.Effectuez la normalisation des quantiles en accédant à Normaliser, Normalisation des quantiles. Annotez les données en accédant à Lignes Annot, Lignes d’annotation catégorielles. Effectuez le test T de l’élève en allant dans Tests, Tests à deux échantillons, sélection des groupes, test à effectuer et la méthode de correction des tests d’hypothèses multiples utilisée pour la troncature.Cette fonction calcule également les ratios log 2. Les phosphotates de phosphoprotéines et leurs interacteurs ont été identifiés dans les cellules HeLa à l’aide d’une expérience de prélèvement PIB, suivie d’une quantification sans étiquette de l’abondance des protéines dans des échantillons traités au DMSO et à la microcystine-LR. Le diagramme volcano de l’analyse par spectrométrie de masse a identifié des liants PIB spécifiques représentés en rouge, des sous-unités catalytiques en bleu et de nouvelles sous-unités PPP candidates, ou protéines en interaction, en blanc.Les liants non spécifiques étaient représentés en gris. Le nuage de points de la zone log2 du lysat de cellules HeLa traité par DMSO a montré que les abondances étaient fortement corrélées, indiquant la reproductibilité des données. L’analyse en réseau de toutes les sous-unités de phosphorprotéine phosphatase et des protéines en interaction a montré que ces protéines étaient des interacteurs spécifiques dans le tirage du PIB.Des analyses protéomiques globales pourraient être effectuées et les résultats comparés à l’analyse du FRP pour déterminer si la composition de ppPome est déterminée par l’abondance de PPP ou régulée par des mécanismes post-traductionnels. PIB-MS est un outil largement applicable qui nous a permis d’identifier les différences dans les modèles d’expression du PPP dans diverses conditions telles que les échantillons interphasiques par rapport aux échantillons mitotiques ou les différences entre les lignées cellulaires cancéreuses.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

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Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

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