Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. erkennt die Unterstützung von NIH R33 CA225458 und R35 GM119455 an. Wir danken den Laboren Kettenbach und Gerber für das hilfreiche Gespräch.

HINWEIS: Die Erzeugung von PIBs erfolgt wie von Moorhead et al. beschrieben, wobei 1 mg Microcystin und etwa 6 ml Sepharis gekoppelt sind, um PIBs mit einer Bindungskapazität von bis zu 5 mg/ml17 zu erzeugen.
1. Probenvorbereitung
HINWEIS: Eine typische Ausgangsmenge für PIB-MS beträgt 1 mg Gesamtprotein pro Zustand. Für dieses Experiment wurden etwa 2,5 x 106 HeLa-Zellen verwendet, um 1 mg Protein zu extrahieren...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS ist ein chemischer Proteomik-Ansatz, der verwendet wird, um das PPPom aus verschiedenen Probenquellen in einer einzigen Analyse quantitativ zu profilieren. Es wurde viel Arbeit mit Kinase-Inhibitor-Perlen geleistet, um das Kinom zu untersuchen und wie es sich bei Krebs und anderen Krankheitszuständenverändert 10,11,12,13. Die Untersuchung des PPPoms hinkt jedoch hinterher. Wir gehen da...

Die Proteinphosphorylierung steuert die meisten zellulären Prozesse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Reaktion auf DNA-Schäden, die Signalisierung des Wachstumsfaktors und die Passage durch Mitose 1,2,3. In Säugetierzellen wird die Mehrheit der Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt an einem oder mehreren Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten phosphoryliert, wobei Phosphosrine und Phosphothreonine etwa 98% aller Phosphorylierungsstellen ausmachen 2,3. Während Kinasen in der zellulären Signalgebung ausführlich untersucht wurden, zeichnet sich die Rolle von PPPs bei der Regulation dynamischer zellulärer Prozesse noch ab.
Die Phosphorylierungsdynamik wird durch das dynamische Zusammenspiel von Kinasen und Phosphatasen gesteuert. In Säugetierzellen gibt es mehr als 400 Proteinkinasen, die die Serin/Threonin-Phosphorylierung katalysieren. Über 90% dieser Stellen werden durch Phosphoproteinphosphatasen (PPPs) dephosphoryliert, eine kleine Familie von Enzymen, die aus PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT und PPZ 2,3 besteht. PP1 und PP2A sind für den Großteil der Phosphoserin- und Phosphothreonin-Dephosphorylierung innerhalb einer Zelle verantwortlich 2,3,4. Der bemerkenswerte Unterschied in der Anzahl zwischen Kinasen und Phosphatasen und die mangelnde Spezifität der PPP-katalytischen Untereinheiten in vitro führten zu der Annahme, dass Kinasen die Hauptdeterminante der Phosphorylierungsind 2,3. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass Phosphatasen die Substratspezifität durch die Bildung multimerer Holoenzyme 5,6,7,8,9 etablieren. Zum Beispiel ist PP1 ein Heterodimer, das aus einer katalytischen Untereinheit und zu einem bestimmten Zeitpunkt aus einer der mehr als 150 regulatorischen Untereinheiten 6,7,8 besteht. Umgekehrt ist PP2A ein Heterotrimer, der aus einem Gerüst (A), einer regulatorischen (B) und einer katalytischen (C)Untereinheit 2,3,9 besteht. Es gibt vier verschiedene Familien von regulatorischen PP2A-Untereinheiten (B55, B56, PR72 und Striatin), jede mit mehreren Genen, Spleißvarianten und Lokalisationsmustern 2,3,9. Die multimere Natur von PPPs füllt die Lücke in der Anzahl der Kinasen und PPP-katalytischen Untereinheiten. Es schafft jedoch analytische Herausforderungen für die Untersuchung der PPP-Signalgebung. Um die PPP-Signalgebung umfassend analysieren zu können, ist es wichtig, die verschiedenen Holoenzyme in einer Zelle oder einem Gewebe zu untersuchen. Große Fortschritte wurden bei der Untersuchung des menschlichen Kinoms durch die Verwendung von Kinase-Inhibitor-Perlen erzielt, die als Multiplex-Inhibitor-Perlen oder Kinobeads bezeichnet werden, eine chemische Proteomstrategie, bei der Kinase-Inhibitoren auf Perlen immobilisiert werden und Massenspektrometrie verwendet wird, um angereicherte Kinasen und ihre Interaktorenzu identifizieren 10,11,12,13.
Wir haben einen ähnlichen Ansatz für das Studium der PPP-Biologie etabliert. Diese Technik beinhaltet die Affinitätserfassung von PPP-katalytischen Untereinheiten unter Verwendung von Perlen mit einem immobilisierten, nicht-selektiven PPP-Inhibitor namens Microcystin-LR (MCLR), der als Phosphatase-Inhibitor-Perlen (PIBs) bezeichnet wird14,15. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die die endogene Markierung oder Expression exogener PPP-Untereinheiten erfordern, die die Proteinaktivität oder -lokalisation verändern könnten, ermöglicht PIB-MS die Anreicherung von endogenen PPP-katalytischen Untereinheiten, ihren assoziierten regulatorischen und gerüstbildenden Untereinheiten und interagierenden Proteinen (als PPPom bezeichnet) aus Zellen und Geweben zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter bestimmten Behandlungsbedingungen. MCLR hemmt PP1, PP2A, PP4-6, PPT und PPZ bei nanomolaren Konzentrationen, wodurch PIBs bei der Anreicherung für dasPPPome 16 hochwirksam sind. Diese Methode kann für den Einsatz auf jedem Ausgangsmaterial von Zellen bis hin zu klinischen Proben skaliert werden. Hier beschreiben wir detailliert den Einsatz von PIBs und Massenspektrometrie (PIB-MS), um das endogene PPPom und seine Modifikationszustände effizient zu erfassen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Visuelle Zusammenfassung des PIB-MS-Protokolls. In einem PIB-MS-Experiment können Proben in verschiedenen Formen gewonnen werden, von Zellen bis hin zu Tumoren. Die Probe wird vor der PPP-Anreicherung gesammelt, lysiert und homogenisiert. Zur Anreicherung für PPPs wird das Lysat mit PIBs mit oder ohne PPP-Inhibitor, wie MCLR, inkubiert. Die PIBs werden dann gewaschen und PPPs werden unter Denaturierungsbedingungen eluiert. Die Proben werden für die massenspektrometrische Analyse durch Entfernen von Reinigungsmitteln durch SP3-Proteinanreicherung, tryptische Verdauung und Entsalzung vorbereitet. Proben können dann vor der massenspektrometrischen Analyse optional TMT-markiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
PIB-MS umfasst die Lyse und Klärung von Zellen oder Geweben, die Inkubation des Lysats mit PIBs, die Elution und die Analyse des Eluats über westliche Blotting- oder Massenspektrometrie-basierte Ansätze (Abbildung 1). Die Zugabe von freiem MCLR kann als Steuerung verwendet werden, um spezifische PIB-Bindemittel von unspezifischen Interaktoren zu unterscheiden. Für die meisten Anwendungen kann ein markierungsfreier Ansatz verwendet werden, um Proteine in Eluaten direkt zu identifizieren. In Fällen, in denen eine genauere Quantifizierung oder die Identifizierung von Arten mit geringer Häufigkeit erforderlich ist, kann die Weiterverarbeitung mit Tandem-Massen-Tag-Kennzeichnung (TMT) verwendet werden, um die Abdeckung zu erhöhen und den Input zu verringern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

Die meisten zellulären Prozesse werden durch dynamische Proteinphosphorylierung reguliert. Mehr als drei Viertel der Proteine sind phosphoryliert, und Phosphoproteinphosphatasen (PPPs) koordinieren über 90% der gesamten zellulären Serin/Threonin-Dephosphorylierung. Die Deregulierung der Proteinphosphorylierung wurde mit der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und Neurodegeneration, in Verbindung gebracht. Trotz ihrer weit verbreiteten Aktivität sind die molekularen Mechanismen, die PPPs kontrollieren, und diejenigen, die von PPPs kontrolliert werden, schlecht charakterisiert. Hier wird ein proteomischer Ansatz beschrieben, der als Phosphatase-Inhibitor-Beads und Massenspektrometrie (PIB-MS) bezeichnet wird, um PPPs, ihre posttranslationalen Modifikationen und ihre Interaktoren in nur 12 h unter Verwendung einer Zelllinie oder eines Gewebes zu identifizieren und zu quantifizieren. PIB-MS verwendet einen nicht-selektiven PPP-Inhibitor, Microcystin-LR (MCLR), der auf Sepharosekügelchen immobilisiert wird, um endogene PPPs und ihre assoziierten Proteine (PPPom genannt) einzufangen und anzureichern. Diese Methode erfordert weder die exogene Expression markierter Versionen von PSM noch die Verwendung spezifischer Antikörper. PIB-MS bietet eine innovative Möglichkeit, die evolutionär konservierten PPPs zu untersuchen und unser derzeitiges Verständnis der Dephosphorylierungssignalisierung zu erweitern.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Abbildung 2: Identifizierung spezifischer PIBs-Bindemittel. (A) Eine Vielzahl von Gewebetypen oder Zellen können mittels PIB-MS analysiert werden. HeLa-Zellen in biologischer Verdreifachung wurden entweder mit DMSO oder dem PPP-Inhibitor MCLR behandelt, mit PIBs inkubiert und mittels LC-MS/MS analysiert. (<str...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung von endogenen Phosphoproteinphosphatasen und ihren interagierenden Proteinen aus Zellen und Geweben und deren Identifizierung und Quantifizierung durch massenspektrometriebasierte Proteomik vor.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS ist eine neuartige Technik, die verwendet wird, um endogene Phosphorproteinphosphatasen anzureichern, und sie interagieren Proteine aus Zellen und Geweben. Es beinhaltet die Identifizierung und Quantifizierung dieser Proteine mittels massenspektrometriebasierter Proteomik. Diese Technik erfordert nicht die exogene Expression von markierten Versionen von Phosphorproteinphosphatasen, die die Proteinaktivität oder -lokalisation verändern könnten.Es werden auch keine Antikörper verwendet, die möglicherweise unspezifisch sind oder nicht in der Lage sind, zwischen bestimmten Isoformen zu unterscheiden. Diese Methode zur Untersuchung des PPPM kann für den Einsatz an allen Zellen bis hin zu klinischen Proben skaliert werden. Sammeln Sie zunächst das Zellpellet durch Zentrifugation bei 277 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS. Bereiten Sie den Lysepuffer wie im Textprotokoll beschrieben vor und halten Sie sich auf Eis. Geben Sie einen Milliliter gekühlten Lysepuffer zu den Proben, homogenisieren Sie dann die Proben durch Sonifikation und halten Sie die Zellen zwischen den Impulsen auf Eis.Die Lysate in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die beschallte Probe bei 21, 130 mal g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie ein Aliquot des Lysats, um die Gesamtproteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Assay zu quantifizieren.Dieser Schritt ist wichtig, um die gleiche Proteinkonzentration in jeder Probe sicherzustellen. Für eine Phosphoproteinphosphatase-Inhibitor-Kontrolle bereiten Sie zwei Aliquots gleicher Proteinkonzentration für jede Probe vor. Lysepuffer kann verwendet werden, um die Proben zu verdünnen, so dass jedes Röhrchen die gleiche Proteinkonzentration hat.Fügen Sie einen Mikromolar freies Microcystin-LR zu einem Aliquot und ein gleiches Volumen von DMSO zum anderen hinzu. Wirbeln Sie die Proben ein und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Die Herstellung der Phosphatase-Inhibitor-Kügelchen sollte im Voraus oder während der im Abschnitt zur Probenvorbereitung beschriebenen Inkubationsschritte erfolgen.Verwenden Sie 10 Mikroliter feste Phosphatase-Inhibitor-Kügelchen oder PIB-Harz für ein Milligramm Protein und fügen Sie sie zu einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu. Waschen Sie die PIBs dreimal mit 0,5 Milliliter Lysepuffer durch Vortexing, gefolgt von Zentrifugation bei 376 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Fügen Sie den gewaschenen PIBs eine angemessene Menge an Lysepuffer hinzu, um eine PIB-Pufferlösung von 50% pro Volumen herzustellen.Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren und Schwenken Sie die Pipettenspitze und die Aufschlämmung, um die PIBs wieder aufzuhängen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Aufschlämmung auf ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 0,5 Milliliter Lysepuffer enthält. Drehen Sie die Schläuche 30 Sekunden lang mit 376 mal g.Jede Röhre enthält gleiche Mengen an PIBs. Verwerfen Sie den Überstand, während Sie nur das feste Harz und bis zu 50 Mikroliter Lysepuffer in jedem Röhrchen belassen. Übertragen Sie die Lysate auf die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen, die PIBs enthalten.Inkubieren Sie das Lysat mit den PIBs für eine Stunde bei 4 Grad Celsius mit einer Rotation bei 8 U / min. Nach der Inkubation mit dem Lysat zentrifugieren Sie die PIBs bei 376 mal g für 30 Sekunden bei 4 Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 0,5 Milliliter Lysepuffer hinzufügen und die Röhrchen umkehren Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Lysepuffer so weit wie möglich, ohne die PIBs zu pipettieren. Bereiten Sie einen Elutionspuffer mit 2% SDS vor und fügen Sie den Elutionspuffer dem Vier- bis Fünffachen des PIB-Volumens hinzu.Eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius inkubieren, um die Phosphoproteinphosphatasen aus den Perlen zu eluieren. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 376 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Sammeln Sie das Eluat in einem separaten Röhrchen und fahren Sie mit Massenspektrometrieanalysen oder Western-Blotting fort.Um die PIBs zu regenerieren, inkubieren Sie sie in 2%SDS-Lösung mit Rotation bei 8 U / min für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen drei- bis fünfmal in 25 millimolaren Tris-HCl pH 7,5 mit Rotation für 30 Minuten pro Waschgang. Lagern Sie PIBs in 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 mit Natriumazid.Für die Massenspektrometrie-Analyse variieren die Methoden der Datenfilterung und -analyse und können vom Forscher oder einer Kerneinrichtung durchgeführt werden. Nachdem Sie die Rohdaten anhand einer artspezifischen Proteomdatenbank durchsucht haben, filtern Sie die Suchergebnisse und exportieren Sie sie als Microsoft Excel-Arbeitsblatt. Analysieren Sie die Daten in dreifacher Ausfertigung.Für eine markierungsfreie Quantifizierung verwenden Sie MS1-Peak-Area-Messungen, um die Daten zu quantifizieren. Um PPP-Untereinheiten und ihre Interaktoren de novo zu identifizieren, vergleichen Sie biologische Triplikate von microcystin-LR-inhibierten und DMSO-behandelten Proben. Filtern Sie die Daten so, dass nur Proteine mit einer Gesamtpeptidzahl von mehr als einem von mindestens zwei der drei DMSO-Kontrollproben vorhanden sind.Um Proteine herauszufiltern, die unspezifisch an das Harz binden, entfernen Sie die Proteine, in denen die Gesamtpeptidzahl im mit Microcystin-LR behandelten Zustand höher ist als bei jeder katalytischen PPP-Untereinheit. Schließen Sie häufige Verunreinigungen wie Keratin, Kollagen, ribosomale Proteine und heterogene nukleäre Ribonukleoproteine von der Analyse aus. Eine CSV-Datei ist für den Import der Daten in Perseus unerlässlich.Importieren Sie gefilterte Daten in Perseus, indem Sie im Abschnitt Laden auf Generischer Matrix-Upload klicken. Transformieren Sie die Daten, indem Sie zu Basic Transform wechseln, die Daten auswählen und die Transformationsfunktion als Protokollbasis 2 von x angeben. Unterstellen Sie fehlende Werte aus einer Normalverteilung, indem Sie zu Imputation, Fehlende Werte aus der Normalverteilung ersetzen, die Daten auswählen und die Breite und die Herunterschaltung für die Berechnung angeben.Führen Sie eine Quantilnormalisierung durch, indem Sie zu Normalisieren, Quantilnormalisierung gehen. Kommentieren Sie die Daten, indem Sie zu Annot-Zeilen, Kategoriale Anmerkungszeilen wechseln. Führen Sie den T-Test des Schülers durch, indem Sie zu Tests, Zwei-Stichproben-Tests, Auswahl der Gruppen, des durchzuführenden Tests und der Methode für die Korrektur mehrerer Hypothesentests, wie sie für das Abschneiden verwendet werden, gehen.Diese Funktion berechnet auch die logarithmischen 2-Verhältnisse. Phosphoproteinphospholate und ihre Interaktoren wurden in den HeLa-Zellen mittels eines PIB-Pulldown-Experiments identifiziert, gefolgt von einer markierungsfreien Quantifizierung der Proteinhäufigkeit in DMSO-behandelten und Microcystin-LR-behandelten Proben. Das Vulkandiagramm der Massenspektrometrie-Analyse identifizierte spezifische PIB-Bindemittel, die in Rot dargestellt sind, katalytische Untereinheiten in Blau und neue PPP-Untereinheiten oder interagierende Proteine in Weiß.Unspezifische Bindemittel wurden grau dargestellt. Das Streudiagramm der log2-Fläche aus dem DMSO-behandelten HeLa-Zelllysat zeigte, dass die Häufigkeiten stark korreliert waren, was auf eine Reproduzierbarkeit der Daten hinweist. Die Netzwerkanalyse aller Phosphorproteinphosphatase-Untereinheiten und interagierenden Proteine zeigte, dass diese Proteine spezifische Interaktoren im PIB-Pulldown waren.Globale Proteomikanalysen könnten durchgeführt und die Ergebnisse mit der PIB-Analyse verglichen werden, um festzustellen, ob die PPPome-Zusammensetzung durch PPP-Häufigkeit gesteuert oder durch posttranslationale Mechanismen reguliert wird. PIB-MS ist ein breit anwendbares Werkzeug, das es uns ermöglicht hat, Unterschiede in PPP-Expressionsmustern unter verschiedenen Bedingungen wie Interphasen- gegenüber mitotischen Proben oder Unterschieden zwischen Krebszelllinien zu identifizieren.

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SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Eine Ratte Methyl-Seq-Plattform um epigenetische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress Exposition zu identifizieren

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...