Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. מכיר בתמיכה של NIH R33 CA225458 ו- R35 GM119455. אנו מודים למעבדות קטנבאך וגרבר על הדיון המועיל.

הערה: הדור של PIBs נעשה כפי שתואר על ידי Moorhead et al., כאשר 1 מ"ג של מיקרוציסטין וכ -6 מ"ל של ספארוז מצומדים כדי ליצור PIBs עם יכולת קשירה של עד 5 מ"ג / מ"ל17.
1. הכנה לדוגמה
הערה: כמות התחלתית טיפוסית עבור PIB-MS היא 1 מ"ג של חלבון כולל לכל מצב. עבור ניסוי זה, בע...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS היא גישה של פרוטאומיקה כימית המשמשת לפרופיל כמותי של ה-PPPome ממקורות דגימה שונים באנליזה אחת. עבודה רבה נעשתה באמצעות חרוזי מעכבי קינאז כדי לחקור את הקינום וכיצד הוא משתנה בסרטן ובמצבי מחלה אחרים 10,11,12,13. עם זאת, המחקר ...

זרחון חלבונים שולט ברוב התהליכים התאיים, כולל אך לא מוגבל לתגובה לנזק לדנ"א, איתות גורמי גדילה ומעבר דרך מיטוזה 1,2,3. בתאי יונקים, רוב החלבונים עוברים זרחון בשאריות סרין, תראונין או טירוזין אחד או יותר בנקודת זמן כלשהי, כאשר פוספוסרינה ופוספוטריאונינים מהווים כ-98% מכלל אתרי הזרחון 2,3. בעוד קינאזות נחקרו בהרחבה באיתות תאי, תפקידם של PPPs בוויסות תהליכים תאיים דינמיים עדיין מתפתח.
דינמיקת הזרחון נשלטת על ידי יחסי הגומלין הדינמיים בין קינאזות לפוספטזות. בתאי יונקים ישנם יותר מ-400 קינאזות חלבוניות המזרזות פוספורילציה של סרין/תראונין. יותר מ-90% מהאתרים האלה עוברים דה-פוספורילציה על-ידי פוספטאזות של פוספופרוטאין (PPPs), משפחה קטנה של אנזימים המורכבת מ-PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT ו-PPZ 2,3. PP1 ו-PP2A אחראים לרוב הפוספוסרין והפוספוטראונין דה-פוספורילציה בתוך תא 2,3,4. ההבדל הבולט במספר בין קינאזות לפוספטזות וחוסר הספציפיות של תת-יחידות קטליטיות PPP במבחנה הובילו לאמונה כי קינאזות הן הגורם העיקרי לזרחון 2,3. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי פוספטזות מבססות את הספציפיות של המצע באמצעות היווצרות של הולואנזים רב-שמריים 5,6,7,8,9. לדוגמה, PP1 הוא הטרודימר המורכב מיחידת משנה קטליטית, ובזמן נתון, אחד מתוך יותר מ -150 תת-יחידות רגולטוריות 6,7,8. לעומת זאת, PP2A הוא הטרוטרימר שנוצר מפיגומים (A), יחידת משנה רגולטורית (B) ותת-יחידהקטליטית (C) 2,3,9. ישנן ארבע משפחות נפרדות של תת-יחידות רגולטוריות של PP2A (B55, B56, PR72 וסטריאטין), שלכל אחת מהן גנים מרובים, גרסאות שחבור ודפוסי לוקליזציה 2,3,9. האופי הרב-מהותי של PPPs ממלא את הפער במספר קינאזות ותת-יחידות קטליטיות של PPP. עם זאת, היא יוצרת אתגרים אנליטיים לחקר איתות PPP. כדי לנתח באופן מקיף איתות PPP, חשוב לחקור את ההולו-אנזים השונים בתוך תא או רקמה. התקדמות גדולה נעשתה בחקר הקינום האנושי באמצעות שימוש בחרוזי מעכבי קינאז, המכונים חרוזי מעכבי מולטיפלקס או קינוביאדות, אסטרטגיה פרוטאומית כימית שבה מעכבי קינאז משותקים על חרוזים וספקטרומטריית מסה משמשת לזיהוי קינאזות מועשרות והאינטראקצים שלהם 10,11,12,13.
ביססנו גישה דומה לחקר הביולוגיה של PPP. טכניקה זו כוללת לכידת זיקה של תת-יחידות קטליטיות PPP באמצעות חרוזים עם מעכב PPP משותק ולא סלקטיבי הנקרא מיקרוציסטין-LR (MCLR) המכונה חרוזי מעכבי פוספטאז (PIBs)14,15. בניגוד לשיטות אחרות הדורשות תיוג אנדוגני או ביטוי של תת-יחידות PPP אקסוגניות שיכולות לשנות את פעילות החלבון או לוקליזציה שלו, PIB-MS מאפשר העשרה של תת-יחידות קטליטיות אנדוגניות של PPP, תת-יחידות רגולטוריות ופיגומים הקשורות אליהן, וחלבונים מתקשרים (המכונים PPPome) מתאים ורקמות בנקודת זמן נתונה או בתנאי טיפול ספציפיים. MCLR מעכב PP1, PP2A, PP4-6, PPT ו-PPZ בריכוזי ננו-מולארים, מה שהופך את ה-PIBs ליעילים ביותר בהעשרת PPPome16. ניתן לשנות את קנה המידה של שיטה זו לשימוש בכל חומר מוצא, מתאים ועד דגימות קליניות. כאן נתאר בפירוט את השימוש ב-PIBs ובספקטרומטריית מסות (PIB-MS) כדי ללכוד, לזהות ולכמת ביעילות את ה-PPPome האנדוגני ואת מצבי השינוי שלו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> איור 1: סיכום חזותי של פרוטוקול PIB-MS. בניסוי PIB-MS ניתן לקבל דגימות בצורות שונות, מתאים ועד גידולים. הדגימה נאספת, משוקרת ומוגזמת לפני העשרת PPP. כדי להעשיר עבור PPPs, lysate הוא דגירה עם PIBs עם או בלי מעכב PPP, כגון MCLR. לאחר מכן נשטפים ה-PIBs, ו-PPPs נשטפים בתנאי דנטורציה. הדגימות מוכנות לניתוח ספקטרומטריית מסה על ידי הסרת חומרי ניקוי באמצעות העשרת חלבוני SP3, עיכול טריפטי והתפלה. לאחר מכן ניתן לתייג דגימות באופן אופציונלי TMT לפני ניתוח ספקטרומטריית מסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
PIB-MS כולל ליזה והבהרה של תאים או רקמות, דגירה של הליזאט עם PIBs, אלוטיון וניתוח של האלואט באמצעות כתמים מערביים או גישות מבוססות ספקטרומטריית מסה (איור 1). התוספת של MCLR חופשי יכולה לשמש כבקרה כדי להבחין בין קלסרים ספציפיים של PIB לבין אינטראקציות לא ספציפיות. עבור רוב היישומים, ניתן להשתמש בגישה נטולת תוויות כדי לזהות ישירות חלבונים ב- eluates. במקרים שבהם יש צורך בדיוק רב יותר בכימות או בזיהוי של מינים בעלי שפע נמוך, ניתן להשתמש בעיבוד נוסף עם תיוג תג מסה טנדם (TMT) כדי להגדיל את הכיסוי ולהפחית את הקלט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

רוב התהליכים התאיים מווסתים על ידי זרחון חלבונים דינמי. יותר משלושה רבעים מהחלבונים עוברים זרחון, ופוספופרוטאין פוספטזות (PPPs) מתאמות יותר מ-90% מכלל הדפוספורילציה של סרין/תראונין תאי. דה-רגולציה של זרחון חלבונים הייתה מעורבת בפתופיזיולוגיה של מחלות שונות, כולל סרטן וניוון עצבי. למרות פעילותם הנרחבת, המנגנונים המולקולריים השולטים ב-PPPs וכאלה הנשלטים על ידי PPPs מאופיינים בצורה גרועה. כאן מתוארת גישה פרוטאומית המכונה חרוזי מעכבי פוספטאז וספקטרומטריית מסה (PIB-MS) כדי לזהות ולכמת PPPs, את השינויים הפוסט-טרנסלציוניים שלהם ואת האינטראקטיביסטים שלהם תוך 12 שעות בלבד באמצעות כל קו תאים או רקמה. PIB-MS משתמש במעכב PPP לא סלקטיבי, microcystin-LR (MCLR), המשותק על חרוזי ספארוז כדי ללכוד ולהעשיר PPPs אנדוגניים ואת החלבונים הקשורים אליהם (המכונים PPPome). שיטה זו אינה דורשת ביטוי אקסוגני של גרסאות מתויגות של PPPs או שימוש בנוגדנים ספציפיים. PIB-MS מציעה דרך חדשנית לחקור את ה-PPPs השמורים מבחינה אבולוציונית ולהרחיב את ההבנה הנוכחית שלנו של איתות דה-פוספורילציה.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> איור 2: זיהוי של קלסרים ספציפיים של PIBs. (A) ניתן לנתח מגוון סוגי רקמות או תאים באמצעות PIB-MS. תאי HeLa במשולש ביולוגי טופלו ב-DMSO או ב-MCLR מעכב ה-PPP, דוגרו באמצעות PIBs, ונותחו באמצעות LC-M...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS היא טכניקה חדשנית המשמשת להעשרת פוספטזות של זרחן-פרוטאין אנדוגני, והם מקיימים אינטראקציה בין חלבונים מתאים ומרקמות. היא כוללת זיהוי וכימות של חלבונים אלה באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות. טכניקה זו אינה דורשת ביטוי אקסוגני של גרסאות מתויגות של פוספטאזות זרחן-פרוטאין שיכולות לשנות את פעילות החלבון או את הלוקליזציה.כמו כן, הוא אינו משתמש בנוגדנים שעשויים להיות לא ספציפיים או שאינם מסוגלים להבחין בין איזופורמים ספציפיים. ניתן לשנות את השיטה הזו לחקר ה-PPPM לשימוש בכל דבר, מתאים ועד דגימות קליניות. כדי להתחיל, לאסוף את כדורי התא על ידי צנטריפוגה ב 277 פעמים גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.הסר את המדיה ושטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS. הכן מאגר ליזיס כמתואר בפרוטוקול הטקסט ושמור על קרח. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ ליזיס מצונן לדגימות, ואז הומוגניזציה של הדגימות על ידי סוניפיקציה ושומרים את התאים על קרח בין פולסים.מעבירים את הליסאטים לצינורות טריים של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימה הקולית ב 21, 130 פעמים גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש באליקווט של הליזאט כדי לכמת את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת חומצה ביצ'ינצ'ונינית.שלב זה חיוני כדי להבטיח ריכוז חלבון שווה בכל דגימה. להדברת מעכבי פוספופרוטאין פוספטאז, הכינו שני אליקוטים בעלי ריכוז חלבון שווה לכל דגימה. ניתן להשתמש במאגר Lysis כדי לדלל את הדגימות כך שלכל צינור יהיה ריכוז חלבון שווה.הוסף מיקרומולר אחד של מיקרוציסטין-LR חופשי לאליקוט אחד ונפח שווה של DMSO לשני. מערבולת את הדגימות ומדגרת אותן על קרח במשך 15 דקות. הכנת חרוזי מעכבי פוספטאז יש לבצע מראש או במהלך שלבי הדגירה המתוארים בסעיף הכנת הדגימה.השתמש ב-10 מיקרוליטרים של חרוזים מעכבי פוספטאז מוצקים, או שרף PIB, עבור מיליגרם אחד של חלבון והוסף אותם לצינור של 1.5 מיליליטר. שטפו את ה-PIBs שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטרים של חיץ ליזיס על ידי מערבולת ואחריה צנטריפוגה ב-376 פעמים גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. הוסף כמות מתאימה של מאגר lysis ל- PIBs השטופים כדי ליצור פתרון מאגר PIB בנפח של 50%.מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים את קצה הפיפטה ואת הסלרי כדי להחיות את ה-PIBs. העבר 20 מיקרוליטרים של ה-slurry לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטרים של מאגר ליזיס. סובב את הצינורות ב 376 פעמים גרם במשך 30 שניות.כל צינור מכיל נפחים שווים של PIBs בו. יש להשליך את ה-supernatant תוך השארת רק את השרף המוצק ועד 50 מיקרוליטרים של חיץ ליזה בכל צינור. העבר את ה- lysates לצינורות המסומנים כראוי המכילים PIBs.דגירה של הליסאט עם ה-PIBs למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-8 סל"ד. לאחר הדגירה עם הליזאט, צנטריפוגה PIBs ב 376 פעמים g במשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 0.5 מיליליטרים של חיץ lysis והפיכת הצינורות לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.חזרו על שלב זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, הסר את מאגר הליזיס ככל האפשר מבלי לטפטף את ה- PIBs. הכן מאגר אלוטיון המכיל 2% SDS והוסף את מאגר האלוטיון פי ארבעה עד חמישה מנפח ה- PIBs.דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לחלץ את הפוספופרוטאין פוספטזות מהחרוזים. צנטריפוגה הצינורות ב 376 פעמים גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאסוף את ה-eluate לתוך שפופרת נפרדת ולהמשיך לניתוח ספקטרומטריית מסות או לכתם מערבי.כדי לחדש את ה-PIBs, דגדרו אותם בתמיסת 2% SDS עם סיבוב ב-8 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את החרוזים שלוש עד חמש פעמים ב-25 מילימולאר Tris-HCl pH 7.5 עם סיבוב למשך 30 דקות לכל שטיפה. אחסן PIBs ב 25 millimolar Tris HCL pH 7.5 עם נתרן אזיד.עבור ניתוח ספקטרומטריית מסות, שיטות סינון וניתוח נתונים משתנות ועשויות להתבצע על ידי החוקר או מתקן הליבה. לאחר חיפוש בנתונים הגולמיים מול מסד נתונים של פרוטאומים ספציפיים למין, סנן את תוצאות החיפוש וייצא אותם כגיליון עבודה של Microsoft Excel. נתחו את הנתונים במשולשים.לכימות ללא תוויות, השתמש במדידות שטח שיא של MS1 כדי לכמת את הנתונים. כדי לזהות תת-יחידות PPP והאינטראקציות שלהן דה נובו, השווה בין טריפליקטים ביולוגיים של דגימות מעכבות מיקרוציסטין-LR לבין דגימות שטופלו ב-DMSO. סנן את הנתונים כך שיהיו רק חלבונים עם ספירת פפטידים כוללת של יותר מאחד מכל לפחות שתיים מתוך שלוש הדגימות שטופלו בבקרת DMSO.כדי לסנן חלבונים שאינם נקשרים באופן ספציפי לשרף, הסר את החלבונים שבהם ספירת הפפטידים הכוללת במצב שטופל במיקרוציסטין-LR גבוהה מזו של כל תת-יחידה קטליטית של PPP. אל תכלול מזהמים נפוצים כגון קרטין, קולגן, חלבונים ריבוזומליים וריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים מהניתוח. קובץ CSV חיוני לייבוא הנתונים לפרסאוס.ייבוא נתונים מסוננים לפרסאוס על-ידי לחיצה על העלאת מטריצה גנרית במקטע טען. הפוך את הנתונים על-ידי מעבר אל 'התמרה בסיסית', בחירת הנתונים וציון פונקציית הטרנספורמציה כבסיס יומן 2 של x. צמצם ערכים חסרים מהתפלגות נורמלית על-ידי מעבר ל- Imputation, החלף ערכים חסרים מהתפלגות נורמלית, בחירת הנתונים וציון הרוחב וההסטה כלפי מטה עבור החישוב.בצע נורמליזציה של קוונטיזציה על ידי מעבר לנורמליזציה של קוונטיזציה. ביאור הנתונים על-ידי מעבר לשורות Annot, שורות ביאור קטגוריאליות. בצע את מבחן T של התלמיד על ידי מעבר למבחנים, מבחנים דו-מדגמיים, בחירת הקבוצות, המבחן לביצוע והשיטה לתיקון בדיקת השערות מרובות כפי שהיא משמשת לקיצוץ.פונקציה זו מחשבת גם את יחסי יומן 2. פוספוטטים של פוספופרוטאין והאינטראקצים שלהם זוהו בתאי HeLa באמצעות ניסוי משיכה של PIB, ולאחר מכן כימות ללא תווית של שפע חלבונים בדגימות שטופלו ב-DMSO ובמיקרוציסטין-LR שטופלו. תרשים הר געש של ניתוח ספקטרומטריית מסות זיהה קלסרים ספציפיים של PIB המוצגים בתת-יחידות אדומות, קטליטיות בכחול, ותת-יחידות PPP מועמדות חדשות, או חלבונים מתקשרים, בלבן.קלסרים לא ספציפיים הוצגו באפור. תרשים פיזור של אזור log2 מהליזאט של תאי HeLa שטופל ב-DMSO הראה כי השפע היה מתואם מאוד, מה שמעיד על יכולת שחזור של הנתונים. ניתוח רשת של כל תת-היחידות של זרחן-פרוטאין פוספטאז והחלבונים המקיימים אינטראקציה הראה כי חלבונים אלה היו אינטראקציות ספציפיות במשיכה של PIB כלפי מטה.ניתן לבצע ניתוחי פרוטאומיקה גלובליים ואת התוצאות בהשוואה לניתוח PIB כדי לקבוע אם הרכב ה- PPPome מונע על ידי שפע PPP או מווסת על ידי מנגנונים פוסט-תרגומיים. PIB-MS הוא כלי ישים באופן נרחב שאיפשר לנו לזהות הבדלים בדפוסי ביטוי PPP בתנאים שונים כגון דגימות אינטרפאזה לעומת מיטוטיות או הבדלים בין קווי תאים סרטניים.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...