Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. riconosce il supporto di NIH R33 CA225458 e R35 GM119455. Ringraziamo i laboratori Kettenbach e Gerber per la loro utile discussione.

NOTA: La generazione di PIB viene effettuata come descritto da Moorhead et al., dove 1 mg di microcistina e circa 6 mL di sefarosio sono accoppiati per generare PIB con una capacità di legame fino a 5 mg/mL17.
1. Preparazione del campione
NOTA: Una quantità iniziale tipica per PIB-MS è di 1 mg di proteina totale per condizione. Per questo esperimento, circa 2,5 x 106 cellule HeLa sono state utilizzate per estrarre...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS è un approccio di proteomica chimica utilizzato per profilare quantitativamente il PPPome da varie fonti di campioni in un'unica analisi. Molto lavoro è stato fatto usando perline inibitrici della chinasi per studiare il kinome e come cambia nel cancro e in altri statipatologici 10,11,12,13. Tuttavia, lo studio del PPPome è in ritardo. Prevediamo che questo approccio sia in grado di c...

La fosforilazione proteica controlla la maggior parte dei processi cellulari, tra cui, ma non solo, la risposta al danno al DNA, la segnalazione del fattore di crescita e il passaggio attraverso la mitosi 1,2,3. Nelle cellule di mammifero, la maggior parte delle proteine sono fosforilate in uno o più residui di serina, treonina o tirosina ad un certo punto nel tempo, con fosfosine e fosfotreonine che costituiscono circa il 98% di tutti i siti di fosforilazione 2,3. Mentre le chinasi sono state ampiamente studiate nella segnalazione cellulare, il ruolo dei PPP nella regolazione dei processi cellulari dinamici sta ancora emergendo.
Le dinamiche di fosforilazione sono controllate dall'interazione dinamica tra chinasi e fosfatasi. Nelle cellule di mammifero, ci sono più di 400 protein chinasi che catalizzano la fosforilazione di serina / treonina. Oltre il 90% di questi siti sono defosforilati dalle fosfatasi fosfoproteiche (PPP), una piccola famiglia di enzimi costituita da PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT e PPZ 2,3. PP1 e PP2A sono responsabili della maggior parte della fosfoserina e della fosfotreonina defosforilazione all'interno di una cellula 2,3,4. La notevole differenza di numero tra chinasi e fosfatasi e la mancanza di specificità delle subunità catalitiche PPP in vitro hanno portato alla convinzione che le chinasi siano il principale determinante della fosforilazione 2,3. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che le fosfatasi stabiliscono la specificità del substrato attraverso la formazione di oloenzimi multimerici 5,6,7,8,9. Ad esempio, PP1 è un eterodimero costituito da una subunità catalitica e, in un dato momento, una delle oltre 150 subunità regolatorie 6,7,8. Al contrario, PP2A è un eterotrimero formato da un'impalcatura (A), una subunità regolatoria (B) e una catalitica (C) 2,3,9. Esistono quattro famiglie distinte di subunità regolatorie PP2A (B55, B56, PR72 e striatina), ognuna con più geni, varianti di giunzione e modelli di localizzazione 2,3,9. La natura multimerica dei PPP colma il divario nel numero di chinasi e subunità catalitiche PPP. Tuttavia, crea sfide analitiche per lo studio della segnalazione PPP. Per analizzare in modo completo la segnalazione PPP, è fondamentale studiare i vari oloenzimi all'interno di una cellula o di un tessuto. Grandi progressi sono stati fatti nello studio del kinome umano attraverso l'uso di perline inibitrici della chinasi, chiamate perle o kinobeadi inibitori multiplex, una strategia proteomica chimica in cui gli inibitori della chinasi sono immobilizzati su perline e la spettrometria di massa viene utilizzata per identificare chinasi arricchite e i loro interattori 10,11,12,13.
Abbiamo stabilito un approccio simile per studiare la biologia PPP. Questa tecnica prevede la cattura di affinità di subunità catalitiche PPP utilizzando perline con un inibitore PPP immobilizzato e non selettivo chiamato microcistin-LR (MCLR) chiamato sfere inibitrici della fosfatasi (PIB)14,15. A differenza di altri metodi che richiedono la marcatura endogena o l'espressione di subunità PPP esogene che potrebbero alterare l'attività o la localizzazione delle proteine, PIB-MS consente l'arricchimento di subunità catalitiche PPP endogene, le loro subunità regolatorie e di impalcatura associate e le proteine interagenti (chiamate PPPome) da cellule e tessuti in un dato momento o in condizioni di trattamento specifiche. MCLR inibisce PP1, PP2A, PP4-6, PPT e PPZ a concentrazioni nanomolari, rendendo i PIB altamente efficaci nell'arricchimento per il PPPome16. Questo metodo può essere scalato per l'uso su qualsiasi materiale di partenza dalle cellule ai campioni clinici. Qui, descriviamo in dettaglio l'uso di PIB e spettrometria di massa (PIB-MS) per catturare, identificare e quantificare in modo efficiente il PPPome endogeno e i suoi stati di modifica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figura 1: Riepilogo visivo del protocollo PIB-MS. In un esperimento PIB-MS, i campioni possono essere ottenuti in varie forme, dalle cellule ai tumori. Il campione viene raccolto, lisato e omogeneizzato prima dell'arricchimento PPP. Per arricchire i PPP, il lisato viene incubato con PIB con o senza un inibitore PPP, come MCLR. I PIB vengono quindi lavati e i PPP vengono eluiti in condizioni di denaturazione. I campioni vengono preparati per l'analisi della spettrometria di massa mediante la rimozione di detergenti attraverso l'arricchimento proteico SP3, la digestione triptica e la desalinizzazione. I campioni possono quindi essere facoltativamente etichettati TMT prima dell'analisi della spettrometria di massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
PIB-MS comporta lisi e chiarificazione di cellule o tessuti, incubazione del lisato con PIB, eluizione e analisi dell'eluato tramite western blotting o approcci basati sulla spettrometria di massa (Figura 1). L'aggiunta di MCLR libero può essere utilizzata come controllo per distinguere specifici leganti PIB da interattori non specifici. Per la maggior parte delle applicazioni, un approccio senza etichette può essere utilizzato per identificare direttamente le proteine negli eluati. Nei casi in cui è necessaria una maggiore precisione nella quantificazione o nell'identificazione di specie a bassa abbondanza, è possibile utilizzare un'ulteriore elaborazione con etichettatura TMT (Tandem Mass-Tag) per aumentare la copertura e ridurre l'input.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

La maggior parte dei processi cellulari sono regolati dalla fosforilazione dinamica delle proteine. Più di tre quarti delle proteine sono fosforilate e le fosfoproteine fosfatasi (PPP) coordinano oltre il 90% di tutta la defosforilazione cellulare di serina/treonina. La deregolazione della fosforilazione proteica è stata implicata nella fisiopatologia di varie malattie, tra cui il cancro e la neurodegenerazione. Nonostante la loro attività diffusa, i meccanismi molecolari che controllano i PPP e quelli controllati dai PPP sono scarsamente caratterizzati. Qui, viene descritto un approccio proteomico chiamato perline inibitrici della fosfatasi e spettrometria di massa (PIB-MS) per identificare e quantificare i PPP, le loro modifiche post-traduzionali e i loro interattori in appena 12 ore utilizzando qualsiasi linea cellulare o tessuto. PIB-MS utilizza un inibitore PPP non selettivo, microcistina-LR (MCLR), immobilizzato su perline di sefarosio per catturare e arricchire i PPP endogeni e le loro proteine associate (chiamate PPPome). Questo metodo non richiede l'espressione esogena di versioni marcate di PPP o l'uso di anticorpi specifici. PIB-MS offre un modo innovativo per studiare i PPP evolutivamente conservati ed espandere la nostra attuale comprensione della segnalazione di defosforilazione.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figura 2: Identificazione di specifici leganti PIB. (A) Una varietà di tipi di tessuto o cellule può essere analizzata tramite PIB-MS. Le cellule HeLa nel tripliceto biologico sono state trattate con DMSO o l'inibitore PPP MCLR, incubate con PIB e analizzate tramite LC-MS / MS. (B) Grafico vu...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Qui presentiamo un protocollo per l'arricchimento delle fosfatasi fosfoproteine endogene e delle loro proteine interagenti da cellule e tessuti e la loro identificazione e quantificazione mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.

Un approccio basato sulla spettrometria di massa per identificare le fosfatasi delle fosfoproteine e i loro interattori

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS è una nuova tecnica utilizzata per arricchire le fosforproteine fosfatasi endogene e sono proteine interagenti da cellule e tessuti. Implica l'identificazione e la quantificazione di queste proteine utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa. Questa tecnica non richiede l'espressione esogena di versioni marcate di fosforproteina fosfatasi che potrebbero alterare l'attività o la localizzazione delle proteine.Inoltre, non utilizza anticorpi che potrebbero essere non specifici o incapaci di distinguere tra isoforme specifiche. Questo metodo per studiare il PPPM può essere scalato per l'uso su tutto, dalle cellule ai campioni clinici. Per iniziare, raccogliere il pellet cellulare mediante centrifugazione a 277 volte g per due minuti a temperatura ambiente.Rimuovere i fluidi e lavare le celle con cinque millilitri di PBS. Preparare il buffer di lisi come descritto nel protocollo di testo e mantenere il ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi refrigerato ai campioni, quindi omogeneizzare i campioni per sonificazione e mantenere le cellule sul ghiaccio tra gli impulsi.Trasferire i lisati in tubi freschi da 1,5 millilitri. Centrifugare il campione sonicato a 21, 130 volte g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Utilizzare un'aliquota del lisato per quantificare la concentrazione totale di proteine utilizzando un test dell'acido bicinchoninico.Questo passaggio è essenziale per garantire la stessa concentrazione proteica in ciascun campione. Per un controllo dell'inibitore della fosfoproteina fosfatasi, preparare due aliquote di uguale concentrazione proteica per ciascun campione. Il tampone di lisi può essere utilizzato per diluire i campioni in modo che ogni tubo abbia la stessa concentrazione proteica.Aggiungere un micromolare di microcistina-LR libera a un'aliquota e un volume uguale di DMSO all'altra. Vortice i campioni e incubarli sul ghiaccio per 15 minuti. La preparazione delle perle inibitrici della fosfatasi deve essere effettuata in anticipo o durante le fasi di incubazione descritte nella sezione di preparazione del campione.Utilizzare 10 microlitri di perle inibitrici della fosfatasi solida, o resina PIB, per un milligrammo di proteine e aggiungerli a un tubo da 1,5 millilitri. Lavare i PIB tre volte con 0,5 millilitri di tampone di lisi mediante vortice seguito da centrifugazione a 376 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di lisi ai PIB lavati per ottenere una soluzione tampone PIB al 50% in volume.Mescolare delicatamente il pipettaggio e ruotare la punta della pipetta e il liquame per risospescere i PIB. Trasferire 20 microlitri del liquame in un tubo da 1,5 millilitri contenente 0,5 millilitri di tampone di lisi. Ruotare i tubi a 376 volte g per 30 secondi.Ogni tubo contiene volumi uguali di PIB in esso. Scartare il surnatante lasciando solo la resina solida e fino a 50 microlitri di tampone di lisi in ciascun tubo. Trasferire i lisati nei tubi opportunamente etichettati contenenti PIB.Incubare il lisato con i PIB per un'ora a 4 gradi Celsius con rotazione a 8 rpm. Dopo l'incubazione con il lisato, centrifugare i PIB a 376 volte g per 30 secondi a 4 gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Lavare le perline aggiungendo 0,5 millilitri di tampone di lisi e invertendo i tubi Raccogliere le perline per centrifugazione e rimuovere il surnatante.Ripeti questo passaggio per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il più possibile il tampone di lisi senza pipettare i PIB. Preparare il tampone di eluizione contenente il 2% di SDS e aggiungere il buffer di eluizione da quattro a cinque volte il volume dei PIB.Incubare a 65 gradi Celsius per un'ora per eluire le fosfoproteine fosfatasi dalle perline. Centrifugare i tubi a 376 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente. Raccogliere l'eluato in un tubo separato e procedere per le analisi di spettrometria di massa o western blotting.Per rigenerare i PIB, incubarli in soluzione 2%SDS con rotazione a 8 rpm per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le perline da tre a cinque volte in Tris-HCl 25 millimolari pH 7,5 con rotazione per 30 minuti per lavaggio. Conservare i PIB in Tris HCL 25 millimolari pH 7,5 con azide di sodio.Per l'analisi della spettrometria di massa, i metodi di filtraggio e analisi dei dati variano e possono essere eseguiti dal ricercatore o da una struttura centrale. Dopo aver cercato i dati grezzi in un database di proteoma specifico per specie, filtrare i risultati della ricerca ed esportarli come foglio di lavoro di Microsoft Excel. Analizzare i dati in triplice copia.Per una quantificazione senza etichetta, utilizzare le misurazioni dell'area di picco MS1 per quantificare i dati. Per identificare le subunità PPP e i loro interattori de novo, confrontare i triplicati biologici di campioni inibiti da microcistina-LR e dmSO trattati. Filtrare i dati in modo che siano presenti solo proteine con un numero totale di peptidi superiore a uno in almeno due dei tre campioni trattati con controllo DMSO.Per filtrare le proteine che non si legano specificamente alla resina, rimuovere le proteine in cui la conta peptidica totale nella condizione trattata con microcistina-LR è superiore a quella di qualsiasi subunità catalitica PPP. Escludere dall'analisi contaminanti comuni come cheratina, collagene, proteine ribosomiali e ribonucleoproteine nucleari eterogenee. Un file CSV è essenziale per importare i dati in Perseo.Importa i dati filtrati in Perseus facendo clic su Caricamento matrice generica nella sezione Carica. Trasformare i dati andando su Trasformazione di base, selezionando i dati e specificando la funzione di trasformazione come log base 2 di x. Imputa i valori mancanti da una distribuzione normale andando su Imputazione, Sostituisci valori mancanti dalla distribuzione normale, selezionando i dati e specificando la larghezza e il downshift per il calcolo.Eseguire la normalizzazione quantile andando a Normalizzare, Normalizzazione quantile. Annotare i dati passando a Righe Annot, Righe di annotazione categoriche. Esegui il test T dello studente andando su Test, Test a due campioni, selezionando i gruppi, il test da eseguire e il metodo per la correzione di test di ipotesi multiple come utilizzato per il troncamento.Questa funzione calcola anche i rapporti log 2. I fosfoproteici fosfofati e i loro interattori sono stati identificati nelle cellule HeLa utilizzando un esperimento di pull-down PIB, seguito da una quantificazione senza etichetta dell'abbondanza proteica in campioni trattati con DMSO e microcistina-LR. Il grafico del vulcano dell'analisi della spettrometria di massa ha identificato specifici leganti PIB mostrati in rosso, subunità catalitiche in blu e nuove subunità PPP candidate, o proteine interagenti, in bianco.I leganti non specifici sono stati mostrati in grigio. Il grafico a dispersione dell'area log2 dal lisato di cellule HeLa trattato con DMSO ha mostrato che le abbondanze erano altamente correlate, indicando la riproducibilità dei dati. L'analisi di rete di tutte le subunità della fosforproteina fosfatasi e delle proteine interagenti ha mostrato che queste proteine erano interattori specifici nel pull-down del PIB.Le analisi proteomiche globali potrebbero essere eseguite e i risultati confrontati con l'analisi PIB per determinare se la composizione del PPPome è guidata dall'abbondanza di PPP o regolata da meccanismi post-traduzionali. PIB-MS è uno strumento ampiamente applicabile che ci ha permesso di identificare le differenze nei modelli di espressione PPP in varie condizioni come l'interfase rispetto ai campioni mitotici o le differenze tra le linee cellulari tumorali.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

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