Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. は、NIH R33 CA225458 および R35 GM119455 からのサポートを認めています。ケッテンバッハ研究所とガーバー研究所の有益な議論に感謝します。

注:PIBの生成は、Moorheadらによって記述されているように行われ、1mgのミクロシスチンおよび約6mLのセファロースが結合されて、最大5mg/mLの結合能を有するPIBを生成する17。
1. サンプル調製
注:PIB-MSの典型的な開始量は、条件ごとに総タンパク質の1mgです。この実験では、約2.5 x106 HeLa細胞を使用して1mgのタンパク質...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MSは、単一の分析でさまざまなサンプルソースからPPPomeを定量的にプロファイリングするために使用される化学プロテオミクスアプローチです。キナーゼ阻害剤ビーズを使用して、キノメとそれが癌および他の疾患状態においてどのように変化するかを研究するために多くの研究が行われてきた10、11、12、13。<s...

タンパク質リン酸化は、DNA損傷に対する応答、成長因子シグナル伝達、および有糸分裂1,2,3の通過を含むがこれらに限定されない、ほとんどの細胞プロセスを制御する。哺乳動物細胞では、タンパク質の大部分は、ある時点で1つ以上のセリン、スレオニン、またはチロシン残基でリン酸化され、ホスホセリンおよびホスホスレオニンは、すべてのリン酸化部位の約98%を占める2,3。キナーゼは細胞シグナル伝達において広く研究されてきたが、動的細胞プロセスの調節におけるPPPの役割はまだ現れている。
リン酸化ダイナミクスは、キナーゼとホスファターゼの間の動的相互作用によって制御される。哺乳類細胞には、セリン/スレオニンリン酸化を触媒する400以上のプロテインキナーゼが存在する。これらの部位の90%以上は、PP1、PP2A、PP2B、PP4-7、PPT、およびPPZ 2,3からなる酵素の小さなファミリーであるリンタンパク質ホスファターゼ(PPP)によって脱リン酸化されている。PP1およびPP2Aは、細胞内のホスホセリンおよびホスホスレオニン脱リン酸化の大部分を担う2、3、4。キナーゼとホスファターゼの数の顕著な違いおよびインビトロでのPPP触媒サブユニットの特異性の欠如は、キナーゼがリン酸化の主な決定因子であるという信念につながった2,3。しかしながら、複数の研究は、ホスファターゼが多量体ホロ酵素5、6、7、8、9の形成を通じて基質特異性を確立することを示している。例えば、PP1は、触媒サブユニットおよび、所与の時点で、150を超える調節サブユニットのうちの1つからなるヘテロ二量体である6、7、8である。逆に、PP2Aは、足場(A)、調節(B)、および触媒(C)サブユニット2,3,9から形成されるヘテロ三量体である。PP2A調節サブユニット(B55、B56、PR72、および線条体)の4つの異なるファミリーがあり、それぞれに複数の遺伝子、スプライスバリアント、および局在化パターン2、3、9がある。PPPの多量体性は、キナーゼおよびPPP触媒サブユニットの数のギャップを埋める。しかし、PPPシグナリングを研究するための分析上の課題が生じます。PPPシグナル伝達を網羅的に解析するためには、細胞または組織内の様々なホロ酵素を調べることが重要です。キナーゼ阻害剤ビーズ(マルチプレックス阻害剤ビーズまたはキノビーズと呼ばれる)の使用を通じてヒトキノメの研究において大きな進歩がなされており、キナーゼ阻害剤がビーズに固定化され、質量分析法が濃縮キナーゼおよびそれらのインターアクターを同定するために使用される化学的プロテオミクス戦略10,11,12,13。
我々は、PPP生物学を研究するために同様のアプローチを確立している。この技術は、ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB)と呼ばれるミクロシスチン−LR(MCLR)と呼ばれる固定化された非選択的PPP阻害剤を有するビーズを用いたPPP触媒サブユニットの親和性捕捉を含む14,15。タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のある外因性PPPサブユニットの内因性タグ付けまたは発現を必要とする他の方法とは異なり、PIB-MSは、内因性PPP触媒サブユニット、それらに関連する調節および足場サブユニット、および所定の時点または特定の治療条件下での細胞および組織からの相互作用タンパク質(PPPomeと呼ばれる)の濃縮を可能にする。MCLRは、PP1、PP2A、PP4-6、PPT、およびPPZをナノモル濃度で阻害し、PIBをPPPome16の濃縮に非常に効果的にする。この方法は、細胞から臨床サンプルまでの任意の出発物質に使用するためにスケーリングすることができる。ここでは、内因性PPPomeとその修飾状態を効率的に捕捉、同定、定量化するためのPIBおよび質量分析(PIB-MS)の使用について詳しく説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> 図1:PIB-MSプロトコルの視覚的な概要 PIB-MS実験では、細胞から腫瘍まで、さまざまな形態でサンプルを得ることができます。サンプルは、PPP 濃縮の前に収集、溶解、および均質化されます。PPPを富化するために、溶解液をMCLRなどのPPP阻害剤の有無にかかわらずPIBと共にインキュベートする。その後、PIBを洗浄し、PPPを変性条件下で溶出します。サンプルは、SP3タンパク質濃縮、トリプシン消化、および脱塩による洗剤の除去によって質量分析分析用に調製される。次いで、サンプルを、質量分析分析の前に任意選択でTMT標識することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
PIB-MSには、細胞または組織の溶解および清澄化、溶解液とPIBとのインキュベーション、溶出、およびウェスタンブロッティングまたは質量分析ベースのアプローチによる溶出液の分析が含まれます(図1)。遊離MCLRの添加は、特異的PIB結合剤を非特異的相互作用体から区別するための対照として使用することができる。ほとんどのアプリケーションでは、溶出液中のタンパク質を直接同定するためにラベルフリーのアプローチを使用できます。定量化または低存在種の同定においてより高い精度が必要な場合は、タンデム質量タグ(TMT)標識によるさらなる処理を使用して、カバレッジを増加させ、入力を減少させることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

ほとんどの細胞プロセスは、動的タンパク質リン酸化によって調節される。タンパク質の4分の3以上がリン酸化されており、リンプロテインホスファターゼ(PPP)はすべての細胞セリン/スレオニン脱リン酸化の90%以上をコーディネートしています。タンパク質リン酸化の調節解除は、癌および神経変性を含む様々な疾患の病態生理学に関与している。それらの広範な活性にもかかわらず、PPPsおよびPPPによって制御される分子機構は、ほとんど特徴付けられていない。ここでは、ホスファターゼ阻害剤ビーズおよび質量分析(PIB-MS)と呼ばれるプロテオミクスアプローチが、任意の細胞株または組織を使用してわずか12時間でPPP、それらの翻訳後修飾、およびそれらの相互作用因子を同定および定量するために記載されている。PIB-MSは、セファロースビーズに固定化された非選択的PPP阻害剤であるミクロシスチン-LR(MCLR)を利用して、内因性PPPおよびその関連タンパク質(PPPomeと呼ばれる)を捕捉および濃縮する。この方法は、PPPのタグ付きバージョンの外因性発現または特異的抗体の使用を必要としない。PIB-MSは、進化的に保存されたPPPを研究し、脱リン酸化シグナル伝達に関する現在の理解を広げる革新的な方法を提供します。

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> 図2:特定のPIBバインダーの同定(A)PIB-MSを介して、さまざまな組織タイプまたは細胞を分析できます。生物学的三連中のHeLa細胞をDMSOまたはPPP阻害剤MCLRで処理し、PIBと共にインキュベートし、LC-MS/MS(B)DMSOおよびMCLR処理HeLa細...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MSは、内因性リンプロテインホスファターゼを濃縮するために使用される新しい技術であり、それらは細胞および組織からのタンパク質と相互作用している。これは、質量分析ベースのプロテオミクスを用いたこれらのタンパク質の同定および定量を含む。この技術は、タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のあるリンタンパク質ホスファターゼのタグ付きバージョンの外因性発現を必要としない。また、非特異的であるか、または特定のアイソフォームを区別できない可能性のある抗体は使用しません。PPPMを調査するためのこの方法は、細胞から臨床サンプルまで、あらゆるもので使用するためにスケーリングすることができる。開始するために、室温で2分間277回gで遠心分離することによって細胞ペレットを集める。培地を除去し、5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。テキストプロトコルに記載されているように溶解バッファーを準備し、氷の上にとどまります。1ミリリットルのチルド溶解バッファーをサンプルに加え、超音波処理によってサンプルを均質化し、パルス間で細胞を氷上に保ちます。ライセートを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。超音波処理したサンプルを21、130回gで4°Cで15分間遠心分離する。溶解物のアリコートを使用して、ビシンコニン酸アッセイを用いて総タンパク質濃度を定量する。このステップは、各サンプル中のタンパク質濃度が等しいことを保証するために不可欠です。リンプロテインホスファターゼ阻害剤対照の場合、各サンプルについて等しいタンパク質濃度の2つのアリコートを調製する。溶解バッファーを使用して、各チューブのタンパク質濃度が等しくなるようにサンプルを希釈することができます。1つのアリコートに1マイクロモルの遊離ミクロシスチン-LRを加え、他方に等量のDMSOを加える。サンプルをボルテックスし、氷上で15分間インキュベートします。ホスファターゼ阻害剤ビーズの調製は、試料調製の項で説明したインキュベーションステップの前または最中に実施されるべきである。1ミリグラムのタンパク質に対して10マイクロリットルの固体ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB樹脂)を使用し、1.5ミリリットルのチューブに加えます。ボルテックス処理により0.5ミリリットルの溶解バッファーでPIBを3回洗浄し、続いて室温で30秒間376回gで遠心分離した。洗浄したPIBに適量の溶解バッファーを加え、50容量%のPIBバッファー溶液を作ります。ピペットチップとスラリーを静かにピペッティングして混合し、PIBを再懸濁します。20マイクロリットルのスラリーを、0.5ミリリットルの溶解緩衝液を含む1.5ミリリットルのチューブに移す。チューブを376回gで30秒間回転させる。各チューブには、同量のPIBが含まれています。各チューブに固形樹脂と最大50マイクロリットルの溶解バッファーのみを残しながら上清を捨てる。溶解物をPIBを含む適切に標識されたチューブに移す。溶解液をPIBと共に摂氏4度で1時間インキュベートし、8rpmで回転させる。溶解液とのインキュベーション後、PIBを摂氏4度で30秒間、376倍gで遠心分離し、上清を除去する。0.5ミリリットルの溶解バッファーを加えてビーズを洗浄し、チューブを反転させます 遠心分離でビーズを集め、上清を除去します。この手順を繰り返して、合計 3 回の洗浄を行います。最終洗浄後、PIBをピペッティングせずに溶解バッファーをできるだけ除去します。2%SDSを含む溶出バッファーを調製し、溶出バッファーをPIBの4~5倍容量で添加します。摂氏65度で1時間インキュベートし、ビーズからリンタンパク質ホスファターゼを溶出させる。チューブを室温で30秒間、376倍gで遠心分離する。溶出液を別のチューブに集め、質量分析分析またはウェスタンブロッティングに進みます。PIBを再生するには、2%SDS溶液中で、8rpmで回転させて室温で1時間インキュベートします。ビーズを25ミリモルのTris-HCl pH 7.5で3〜5回洗浄し、洗浄あたり30分間回転させる。PIBをアジ化ナトリウムと共に25ミリモルのトリスHCL pH 7.5に貯蔵する。質量分析分析の場合、データのフィルタリングおよび分析の方法はさまざまで、研究者または中核施設によって実行され得る。種固有のプロテオーム データベースに対して生データを検索した後、検索結果をフィルター処理し、Microsoft Excel ワークシートとしてエクスポートします。データを 3 つずつ分析します。ラベルのない定量化のために、MS1ピーク面積測定を使用してデータを定量化します。PPPサブユニットおよびそれらのインターアクターde novoを同定するために、ミクロシスチン-LR阻害およびDMSO処理サンプルの生物学的三連を比較する。3 つの DMSO 対照処理サンプルのうち少なくとも 2 つにおいて、合計ペプチド数が 1 を超えるタンパク質のみが存在するようにデータをフィルタリングします。樹脂に非特異的に結合するタンパク質を除外するには、ミクロシスチン-LR処理条件における総ペプチド数がPPP触媒サブユニットの総ペプチド数よりも多いタンパク質を除去する。ケラチン、コラーゲン、リボソームタンパク質、不均一な核リボヌクレオタンパク質などの一般的な汚染物質を分析から除外します。CSVファイルは、ペルセウスにデータをインポートするために不可欠です。フィルター処理されたデータを Perseus にインポートするには、[読み込み] セクションの [汎用マトリックスのアップロード] をクリックします。基本変換に移動し、データを選択し、変換関数を x の対数ベース 2 として指定して、データを変換します。正規分布から欠損値を求めるには、[代入]、[正規分布の欠損値を置き換える]に移動し、データを選択し、計算の幅とシフトを下げます。分位点正規化を実行するには、[正規化]、[分位点正規化] の順に移動します。アノット行、カテゴリ注釈行に移動してデータに注釈を付けます。テスト、2サンプル検定に移動し、グループ、実行する検定、および切り捨てに使用する多重仮説検定修正の方法を選択して、学生のT検定を実行します。この関数は、対数 2 比も計算します。リンタンパク質ホスホテートおよびそのインターアクターを、PIBプルダウン実験を用いてHeLa細胞において同定し、続いてDMSO処理およびミクロシスチン-LR処理サンプル中のタンパク質存在量の標識フリー定量を行った。質量分析の火山プロットでは、特定のPIBバインダーが赤、触媒サブユニットが青、新しい候補PPPサブユニット、または相互作用タンパク質が白で示されました。非特異的結合剤は灰色で示した。DMSO処理HeLa細胞溶解物からのlog2領域の散布図は、存在量が高度に相関していることを示し、データの再現性を示した。すべてのリンタンパク質ホスファターゼサブユニットおよび相互作用タンパク質のネットワーク解析は、これらのタンパク質がPIBプルダウンにおける特異的相互作用因子であることを示した。グローバルプロテオミクス解析を実施し、その結果をPIB解析と比較して、PPPome組成がPPPの存在量によって駆動されるのか、翻訳後メカニズムによって調節されているのかを判断することができます。PIB-MSは広く適用可能なツールであり、同相間サンプルと有糸分裂サンプルの違い、がん細胞株間の差異など、さまざまな条件下でのPPP発現パターンの違いを特定することができました。

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

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液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

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