Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. anerkjenner støtte fra NIH R33 CA225458 og R35 GM119455. Vi takker Kettenbach og Gerber labs for deres hjelpsomme diskusjon.

MERK: Genereringen av PIBer gjøres som beskrevet av Moorhead et al., hvor 1 mg mikrocystin og ca. 6 ml sepharose kombineres for å generere PIB-er med en bindingskapasitet på opptil 5 mg/ml17.
1. Prøvepreparering
MERK: Et typisk startbeløp for PIB-MS er 1 mg totalt protein per tilstand. For dette eksperimentet ble ca. 2,5 x 106 HeLa-celler brukt til å trekke ut 1 mg protein. Denne beregningen bør utføres for h...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS er en kjemisk proteomisk tilnærming som brukes til kvantitativ profilering av PPPome fra ulike prøvekilder i en enkelt analyse. Det er gjort mye arbeid med kinasehemmerperler for å studere kinome og hvordan det endrer seg i kreft og annen sykdom sier 10,11,12,13. Likevel henger studiet av PPPome etter. Vi forventer at denne tilnærmingen er i stand til å fylle dette gapet og belyse r...

Proteinfosforylering kontrollerer de fleste cellulære prosesser, inkludert, men ikke begrenset til, responsen på DNA-skade, vekstfaktorsignalering og passasjen gjennom mitose 1,2,3. I pattedyrceller er flertallet av proteiner fosforylert ved en eller flere serin-, treon- eller tyrosinrester på et tidspunkt, med fosforeriner og fosforetoniner som består av omtrent 98% av alle fosforyleringssteder 2,3. Mens kinases har blitt grundig studert i cellulær signalering, vises fortsatt PPPs rolle i reguleringen av dynamiske cellulære prosesser.
Fosforyleringsdynamikken styres av det dynamiske samspillet mellom kinaser og fosfater. I pattedyrceller er det mer enn 400 proteinkinaser som katalyserer serin / treoninfosforylering. Over 90% av disse nettstedene er defosforylatert av fosfoproteinfosfater (PPPer), en liten familie av enzymer som består av PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT og PPZ 2,3. PP1 og PP2A er ansvarlige for de fleste fosfor og fosforondefosforylering i en celle 2,3,4. Den bemerkelsesverdige forskjellen i antall mellom kinases og fosfater og mangelen på spesifisitet av PPP katalytiske subenheter in vitro førte til troen på at kinases er den viktigste determinanten for fosforylering 2,3. Imidlertid har flere studier vist fosfater for å etablere substratspesifikkitet gjennom dannelsen av multimeriske holoenzymer 5,6,7,8,9. For eksempel er PP1 en heterodimer som består av en katalytisk underenhet og på et gitt tidspunkt en av de mer enn 150 regulatoriske underenhetene 6,7,8. På den annen side er PP2A en heterotrimer som er dannet av et stillas (A), en regulatorisk (B) og en katalytisk (C) underenhet 2,3,9. Det er fire forskjellige familier av PP2A regulatoriske underenheter (B55, B56, PR72 og striatin), hver med flere gener, skjøtevarianter og lokaliseringsmønstre 2,3,9. Den multimeriske naturen til PPPer fyller gapet i antall kinases og PPP katalytiske underenheter. Det skaper imidlertid analytiske utfordringer for å studere PPP-signalering. For å analysere PPP-signalering grundig, er det viktig å undersøke de forskjellige holoenzymene i en celle eller et vev. Store fremskritt har blitt gjort i å studere den menneskelige kinome gjennom bruk av kinase inhibitor perler, betegnet multiplex inhibitor perler eller kinobeads, en kjemisk proteomisk strategi der kinase inhibitors er immobilisert på perler og masse spektrometri brukes til å identifisere beriket kinases og deres interagere 10,11,12,13.
Vi har etablert en lignende tilnærming for å studere PPP-biologi. Denne teknikken innebærer affinitetsfangst av PPP-katalytiske underenheter ved hjelp av perler med en immobilisert, ikke-selektiv PPP-hemmer kalt microcystin-LR (MCLR) kalt fosfatasehemmerperler (PIB)14,15. I motsetning til andre metoder som krever endogen merking eller uttrykk for eksogene PPP-underenheter som kan endre proteinaktivitet eller lokalisering, tillater PIB-MS berikelse av endogene PPP-katalytiske underenheter, deres tilhørende regulatoriske og stillasunderenheter, og interagerende proteiner (kalt PPPome) fra celler og vev på et gitt tidspunkt eller under spesifikke behandlingsforhold. MCLR hemmer PP1, PP2A, PP4-6, PPT og PPZ ved nanomolarkonsentrasjoner, noe som gjør PIBer svært effektive til å berike for PPPome16. Denne metoden kan skaleres for bruk på ethvert startmateriale fra celler til kliniske prøver. Her beskriver vi i detalj bruken av PIBer og massespektrometri (PIB-MS) for effektivt å fange, identifisere og kvantifisere den endogene PPPome og dens modifikasjonstilstander.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figur 1: Visuelt sammendrag av PIB-MS-protokollen. I et PIB-MS-eksperiment kan prøver fås i forskjellige former, fra celler til svulster. Prøven samles inn, lyser og homogeniseres før PPP-berikelse. For å berike for PPPer inkuberes lysatet med PIBer med eller uten PPP-hemmer, for eksempel MCLR. PIB-ene vaskes deretter, og PPPer elutes under denatureringsforhold. Prøvene er utarbeidet for massespektrometrianalyse ved fjerning av vaskemidler gjennom SP3 proteinberikelse, tryptisk fordøyelse og avsalting. Prøver kan deretter eventuelt TMT-merket før massespektrometrianalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
PIB-MS innebærer lysis og avklaring av celler eller vev, inkubasjon av lysatet med PIBer, elution og analyse av eluate via vestlig blotting eller massespektrometribaserte tilnærminger (figur 1). Tillegg av gratis MCLR kan brukes som en kontroll for å skille spesifikke PIB-permer fra ikke-spesifikke interagere. For de fleste applikasjoner kan en etikettfri tilnærming brukes til å identifisere proteiner direkte i eluates. I tilfeller der større presisjon i kvantifisering eller identifisering av lav-overflod arter er nødvendig, kan videre behandling med tandem masse-tag (TMT) merking brukes til å øke dekningen og redusere inngang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

De fleste cellulære prosesser reguleres av dynamisk proteinfosforylering. Mer enn tre fjerdedeler av proteiner er fosforylert, og fosfoproteinfosfater (PPPer) koordinerer over 90% av all cellulær serin / treonin defosforylering. Deregulering av proteinfosforylering har vært involvert i patofysiologien til ulike sykdommer, inkludert kreft og nevrodegenerasjon. Til tross for deres utbredte aktivitet er de molekylære mekanismene som kontrollerer PPPer og de som kontrolleres av PPPer dårlig preget. Her beskrives en proteomisk tilnærming kalt fosfatasehemmerperler og massespektrometri (PIB-MS) for å identifisere og kvantifisere PPPer, deres posttranslasjonelle modifikasjoner og deres interaktivitet i så lite som 12 timer ved hjelp av en hvilken som helst cellelinje eller vev. PIB-MS bruker en ikke-selektiv PPP-hemmer, mikrocystin-LR (MCLR), immobilisert på sepharoseperler for å fange og berike endogene PPPer og deres tilknyttede proteiner (kalt PPPome). Denne metoden krever ikke det eksogene uttrykket av taggede versjoner av PPPer eller bruk av spesifikke antistoffer. PIB-MS tilbyr en innovativ måte å studere de evolusjonært bevarte PPP-ene og utvide vår nåværende forståelse av defosforyleringssignalering.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figur 2: Identifisering av spesifikke PIBs bindemidler. (A) En rekke vevstyper eller celler kan analyseres via PIB-MS. HeLa-celler i biologisk triplikat ble enten behandlet med DMSO eller PPP-hemmeren MCLR, inkubert med PIBer, og analysert via LC-MS/MS. (B) Vulkanplott av PIB-MS-analyse i DMSO-...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Her presenterer vi en protokoll for berikelse av endogene fosfoproteinfosfater og deres interagerende proteiner fra celler og vev og deres identifisering og kvantifisering ved massespektrometribasert proteomikk.

En massespektrometribasert tilnærming for å identifisere fosfoproteinfosfater og deres interagere

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS er en ny teknikk som brukes til å berike for endogene fosforproteinfosfater, og de samhandler proteiner fra celler og vev. Det innebærer identifisering og kvantifisering av disse proteinene ved hjelp av massespektrometribasert proteomikk. Denne teknikken krever ikke det eksogene uttrykket av taggede versjoner av fosforproteinfosfater som kan endre proteinaktivitet eller lokalisering.Den bruker heller ikke antistoffer som kan være ikke-spesifikke eller ute av stand til å skille mellom spesifikke isoformer. Denne metoden for å undersøke PPPM kan skaleres for bruk på alt fra celler til kliniske prøver. Til å begynne med, samle cellepellet ved sentrifugering ved 277 ganger g i to minutter ved romtemperatur.Fjern medier og vask cellene med fem milliliter PBS. Forbered lysisbufferen som beskrevet i tekstprotokollen og hold deg på is. Tilsett en milliliter kjølt lysisbuffer i prøvene, homogeniser deretter prøvene ved sonifisering og hold cellene på is mellom pulser.Overfør lysates til friske 1,5 milliliter rør. Sentrifuger den sonikerte prøven ved 21, 130 ganger g i 15 minutter ved 4 grader Celsius. Bruk en aliquot av lysatet for å kvantifisere den totale proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en bicinkoninsyreanalyse.Dette trinnet er viktig for å sikre lik proteinkonsentrasjon i hver prøve. For en fosfoproteinfosfatasehemmerkontroll, lag to aliquots med lik proteinkonsentrasjon for hver prøve. Lysis buffer kan brukes til å fortynne prøvene slik at hvert rør har lik proteinkonsentrasjon.Legg til en mikromolar gratis mikrocystin-LR i den ene aliquoten og et likt volum DMSO til den andre. Virvel prøvene og inkuber dem på is i 15 minutter. Forberedelse av fosfatasehemmerperler bør utføres på forhånd eller under inkubasjonstrinnene som er beskrevet i prøveprepareringsdelen.Bruk 10 mikroliter faste fosfatasehemmerperler, eller PIB-harpiks, for ett milligram protein og legg dem til et 1,5 milliliter rør. Vask PIBs tre ganger med 0,5 milliliter lysisbuffer ved virvel etterfulgt av sentrifugering ved 376 ganger g i 30 sekunder ved romtemperatur. Legg til en passende mengde lysisbuffer i de vaskede PIB-ene for å lage 50 % etter volum-PIB-bufferløsning.Bland ved å forsiktig pipettere og virvle pipettespissen og slammet for å resuspendere PIB-ene. Overfør 20 mikroliter av slammet til et 1,5 milliliter rør som inneholder 0,5 milliliter lysisbuffer. Snurr rørene 376 ganger g i 30 sekunder.Hvert rør inneholder like store mengder PIBer i det. Kast supernatanten mens du bare etterlater den faste harpiksen og opptil 50 mikroliter lysisbuffer i hvert rør. Overfør lysatene til de passende merkede rørene som inneholder PIBer.Inkuber lysatet med PIB-ene i en time ved 4 grader Celsius med rotasjon ved 8 rpm. Etter inkubasjon med lysatet, sentrifuger PIB-ene ved 376 ganger g i 30 sekunder ved 4 grader Celsius og fjern supernatanten. Vask perlene ved å tilsette 0,5 milliliter lysisbuffer og invertere rørene Samle perlene ved sentrifugering og fjern supernatanten.Gjenta dette trinnet for totalt tre vasker. Etter den endelige vasken, fjern lysisbufferen så mye som mulig uten å pipettere opp PIB-ene. Klargjør elutionbuffer som inneholder 2 %SDS, og legg til elutionbufferen fire til fem ganger volumet av PIBer.Inkuber ved 65 grader Celsius i en time for å unngå fosfoproteinfosfater fra perlene. Sentrifuger rørene ved 376 ganger g i 30 sekunder ved romtemperatur. Samle eluate i et eget rør og fortsett for massespektrometrianalyser eller vestlig blotting.For å regenerere PIB-ene, inkuber dem i 2% SDS-løsning med rotasjon ved 8 rpm i en time ved romtemperatur. Vask perlene tre til fem ganger i 25 millimolar Tris-HCl pH 7,5 med rotasjon i 30 minutter per vask. Oppbevar PIBer i 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 med natriumazid.For massespektrometrianalyse varierer metoder for datafiltrering og analyse og kan utføres av forskeren eller et kjerneanlegg. Når du har søkt i rådataene mot en artsspesifikk proteomdatabase, filtrerer du søkeresultatene og eksporterer dem som et Microsoft Excel-regneark. Analyser dataene i triplikater.For etikettfri kvantifisering, bruk MS1-toppområdemålinger for å kvantifisere dataene. For å identifisere PPP-underenheter og deres interagere de novo, sammenlign biologiske triplikater av mikrocystin-LR-hemmet og DMSO-behandlede prøver. Filtrer dataene slik at bare proteiner med et totalt peptidantall på mer enn en av minst to av de tre DMSO-kontrollbehandlede prøvene er til stede.For å filtrere ut proteiner som ikke spesifikt binder seg til harpiksen, fjern proteinene der det totale peptidantallet i den mikrocystin-LR-behandlede tilstanden er høyere enn for noen PPP katalytisk subenhet. Utelukke vanlige forurensninger som keratin, kollagen, ribosomale proteiner og heterogene nukleære ribonukleoproteiner fra analysen. En CSV-fil er viktig for å importere dataene til Perseus.Importer filtrerte data til Perseus ved å klikke Generisk matriseopplasting i Last inn-delen. Transformer dataene ved å gå til Grunnleggende transformering, merke dataene og angi transformasjonsfunksjonen som loggbase 2 av x. Imputer manglende verdier fra en normalfordeling ved å gå til Imputering, Erstatte manglende verdier fra normalfordeling, merke dataene og angi bredden og downshift for beregningen.Utfør kvantil normalisering ved å gå til Normalize, Quantile normalisering. Kommenter dataene ved å gå til Annot-rader, Kategoriske merknadsrader. Utfør studentens T-test ved å gå til Tester, To-utvalgstester, velge gruppene, testen som skal utføres og metoden for multippel hypotesetestingskorreksjon som brukes til avkorting.Denne funksjonen beregner også log 2-forholdet. Fosfoproteinfotater og deres interagere ble identifisert i HeLa-cellene ved hjelp av et PIB-nedtrekkseksperiment, etterfulgt av etikettfri kvantifisering av proteinoverflod i DMSO-behandlede og mikrocystin-LR-behandlede prøver. Vulkanplott av massespektrometrianalyse identifiserte spesifikke PIB-bindemidler vist i røde, katalytiske underenheter i blått, og nye kandidat PPP-underenheter, eller interagerende proteiner, i hvitt.Ikke-spesifikke dokumentordnere ble vist i grått. Scatter-plott av log2-området fra DMSO-behandlet HeLa-cellelysat viste at overflodene var svært korrelert, noe som indikerer reproduserbarhet av dataene. Nettverksanalyse av alle fosforproteinfosfataseunderenheter og interagerende proteiner viste at disse proteinene var spesifikke interagere i PIB-nedtrekket.Globale proteomikkanalyser kan utføres og resultatene sammenlignet med PIB-analysen for å avgjøre om PPPome-sammensetningen drives av PPP-overflod eller reguleres av postoversettelsesmekanismer. PIB-MS er et bredt anvendelig verktøy som har gjort det mulig for oss å identifisere forskjeller i PPP-uttrykksmønstre under ulike forhold som interfase versus mititotiske prøver eller forskjeller mellom kreftcellelinjer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En rotte Methyl-Seq plattform å identifisere Epigenetic endringer knyttet til Stress eksponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...