Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A A.N.K. reconhece o suporte do NIH R33 CA225458 e R35 GM119455. Agradecemos aos laboratórios Kettenbach e Gerber por sua discussão útil.

NOTA: A geração de PIBs é feita conforme descrito por Moorhead et al., onde 1 mg de microcistina e cerca de 6 mL de sepharose são acoplado para gerar PIBs com capacidade de ligação de até 5 mg/mL17.
1. Preparação da amostra
NOTA: Uma quantidade inicial típica para PIB-MS é de 1 mg de proteína total por condição. Para este experimento, aproximadamente 2,5 x 106 células HeLa foram utilizadas para extrair...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS é uma abordagem química de proteômica usada para traçar o perfil quantitativo do PPPome de várias fontes de amostra em uma única análise. Muito trabalho tem sido feito usando contas inibidoras de quinase para estudar o kinome e como ele muda no câncer e outros estados da doença 10,11,12,13. No entanto, o estudo do PPPome fica para trás. Prevemos que essa abordagem seja capaz de...

A fosforilação proteica controla a maioria dos processos celulares, incluindo, mas não se limitando à resposta a danos no DNA, sinalização de fator de crescimento e a passagem pela mitose 1,2,3. Em células de mamíferos, a maioria das proteínas são fosfoiladas em um ou mais resíduos de soro, threonina ou tyrosina em algum momento, com fosfoserinas e fosfothreoninas compreendendo aproximadamente 98% de todos os locais de fosforilação 2,3. Embora as cinesases tenham sido extensivamente estudadas na sinalização celular, o papel das PPPs na regulação de processos celulares dinâmicos ainda está surgindo.
A dinâmica da fosforilação é controlada pela interação dinâmica entre quinases e fosfates. Nas células mamíferas, existem mais de 400 quinases proteicas que catalisam a fosforilação serina/threonina. Mais de 90% desses locais são desfosforilados por fosfoproteínas (PPPs), uma pequena família de enzimas que consiste em PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT e PPZ 2,3. PP1 e PP2A são responsáveis pela maioria da fosfoserina e fosfotoreonina desfosforilação dentro de uma célula 2,3,4. A notável diferença de número entre quinases e fosfattases e a falta de especificidade das subunidades catalíticas PPP in vitro levaram à crença de que as quinases são o principal determinante da fosforilação 2,3. No entanto, vários estudos mostraram fosfatidades para estabelecer especificidade de substrato através da formação de holoenzimas multimédicos 5,6,7,8,9. Por exemplo, o PP1 é um heterodimer que consiste em uma subunidade catalítica e, em um dado momento, uma das mais de 150 subunidades regulatórias 6,7,8. Por outro lado, PP2A é um heterotrimer que é formado por andaimes (A), um regulador (B) e uma subunidade catalítica (C) 2,3,9. Existem quatro famílias distintas de subunidades regulatórias PP2A (B55, B56, PR72 e striatina), cada uma com múltiplos genes, variantes de emenda e padrões de localização 2,3,9. A natureza multimérica das PPPs preenche a lacuna no número de quinases e subunidades catalíticas PPP. No entanto, cria desafios analíticos para o estudo da sinalização PPP. Para analisar de forma abrangente a sinalização PPP, é fundamental investigar as várias holoenzimias dentro de uma célula ou tecido. Grandes avanços foram feitos no estudo do kinome humano através do uso de contas inibidoras de quinase, denominadas contas inibidoras multiplex ou kinobeads, uma estratégia proteômica química onde os inibidores da quinase são imobilizados em contas e espectrometria de massa é usado para identificar quinases enriquecidas e seus interageres 10,11,12,13.
Estabelecemos uma abordagem semelhante para estudar biologia ppp. Esta técnica envolve a captura de afinidade de subunidades catalíticas PPP utilizando contas com um inibidor ppp imobilizado e não seletivo chamado microcistina-LR (MCLR) chamado de contas inibidoras de fosfatase (PIBs)14,15. Ao contrário de outros métodos que requerem a marcação endógena ou expressão de subunidades exógenas de PPP que poderiam alterar a atividade ou localização da proteína, o PIB-MS permite o enriquecimento de subunidades catatróticas PPP endógenas, suas subunidades regulatórias e andaimes associadas, e proteínas interativas (denominadas PPPome) a partir de células e tecidos em um determinado ponto de tempo ou sob condições específicas de tratamento. A MCLR inibe pp1, PP2A, PP4-6, PPT e PPZ em concentrações de nanomolar, tornando os PIBs altamente eficazes no enriquecimento para o PPPome16. Este método pode ser dimensionado para uso em qualquer material inicial de células para amostras clínicas. Aqui, descrevemos em detalhes o uso de PIBs e espectrometria de massa (PIB-MS) para capturar, identificar e quantificar eficientemente o PPPome endógeno e seus estados de modificação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figura 1: Resumo visual do protocolo PIB-MS. Em um experimento PIB-MS, as amostras podem ser obtidas de várias formas, desde células até tumores. A amostra é coletada, líseda e homogeneizada antes do enriquecimento de PPP. Para enriquecer para PPPs, o lysate é incubado com PIBs com ou sem um inibidor de PPP, como o MCLR. Os PIBs são então lavados, e as PPPs são elucidadas em condições de desnaturação. As amostras são preparadas para análise de espectrometria de massa pela remoção de detergentes através do enriquecimento de proteína SP3, digestão tripptica e dessalção. As amostras podem então ser rotuladas opcionalmente de TMT antes da análise de espectrometria de massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O PIB-MS envolve lise e esclarecimento de células ou tecidos, incubação do lysate com PIBs, elução e análise do elunato por meio de manchas ocidentais ou abordagens baseadas em espectrometria de massa (Figura 1). A adição de MCLR gratuito pode ser usada como um controle para distinguir aglutinantes PIB específicos de interagidores não específicos. Para a maioria das aplicações, uma abordagem sem rótulos pode ser usada para identificar diretamente proteínas em eluatos. Nos casos em que é necessária maior precisão na quantificação ou identificação de espécies de baixa abundância, o processamento posterior com rotulagem tandem mass tag (TMT) pode ser usado para aumentar a cobertura e diminuir a entrada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

A maioria dos processos celulares são regulados pela fosforilação dinâmica da proteína. Mais de três quartos das proteínas são fosfoiladas, e fosfoprotetases fosfoproteínas (PPPs) coordenam mais de 90% de toda a desfosforilação serina/threonina celular. A desregulamentação da fosforilação proteica tem sido implicada na fisiopatologia de várias doenças, incluindo câncer e neurodegeneração. Apesar de sua atividade generalizada, os mecanismos moleculares que controlam as PPPs e os controlados pelas PPPs são pouco caracterizados. Aqui, uma abordagem proteômica denominada contas inibidoras de fosfattase e espectrometria de massa (PIB-MS) é descrita para identificar e quantificar PPPs, suas modificações pós-translacionais e seus interagentes em apenas 12 h usando qualquer linha celular ou tecido. O PIB-MS utiliza um inibidor de PPP não seletivo, microcistina-LR (MCLR), imobilizado em contas de sepharose para capturar e enriquecer PPPs endógenos e suas proteínas associadas (denominada PPPome). Este método não requer a expressão exógena das versões marcadas de PPPs ou o uso de anticorpos específicos. O PIB-MS oferece uma maneira inovadora de estudar as PPPs evolutivamente conservadas e expandir nossa compreensão atual da sinalização de desfosforilação.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figura 2: Identificação de aglutinantes específicos de PIBs. (A) Uma variedade de tipos de tecidos ou células pode ser analisada via PIB-MS. As células HeLa em triplicado biológico foram tratadas com DMSO ou com o INibidor de PPP MCLR, incubadas com PIBs, e analisadas via LC-MS/MS. (B) O ...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Aqui, apresentamos um protocolo para o enriquecimento de fosfatrofames fosfoproteínas e suas proteínas interativas a partir de células e tecidos e sua identificação e quantificação por proteômica baseada em espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS é uma nova técnica usada para enriquecer fosfarprotetases esforprotetases e estão interagindo proteínas de células e tecidos. Envolve a identificação e quantificação dessas proteínas usando proteômica à base de espectrometria de massa. Esta técnica não requer a expressão exógena de versões marcadas de fosforprotetases fosforproteínas que poderiam alterar a atividade proteica ou a localização.Além disso, não usa anticorpos que possam ser não específicos ou incapazes de distinguir entre isoformes específicos. Este método de investigação do PPPM pode ser dimensionado para uso em tudo, desde células até amostras clínicas. Para começar, colete a pelota celular por centrifugação a 277 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente.Remova a mídia e lave as células com cinco mililitros de PBS. Prepare o tampão de lise conforme descrito no protocolo de texto e mantenha no gelo. Adicione um mililitro de tampão de lise resfriado às amostras, homogeneize as amostras por sonificação e mantenha as células no gelo entre os pulsos.Transfira os lises para tubos frescos de 1,5 mililitro. Centrifugar a amostra sonicada a 21,130 vezes g por 15 minutos a 4 graus Celsius. Use uma alíquota do lisato para quantificar a concentração total de proteínas usando um ensaio de ácido bicinchonínico.Esta etapa é essencial para garantir a concentração igualitária de proteínas em cada amostra. Para um controle inibidor de fosfoproteína fosfaprotetora, prepare duas alíquotas de concentração de proteína igual para cada amostra. O tampão de lise pode ser usado para diluir as amostras para que cada tubo tenha concentração de proteína igual.Adicione um micromolar de microcistina-LR livre a uma alíquota e um volume igual de DMSO ao outro. Vórtice as amostras e incuba-as no gelo por 15 minutos. A preparação das contas inibidoras de fosfatase deve ser realizada com antecedência ou durante as etapas de incubação descritas na seção de preparação da amostra.Use 10 microlitadores de contas inibidoras de fosfattase sólida, ou resina PIB, para um miligrama de proteína e adicione-as a um tubo de 1,5 mililitro. Lave os PIBs três vezes com 0,5 mililitros de tampão de lise por vórtice seguido de centrifugação a 376 vezes g por 30 segundos em temperatura ambiente. Adicione uma quantidade apropriada de tampão de lise aos PIBs lavados para fazer 50% por volume solução de buffer PIB.Misture suavemente a pipetação e gire a ponta da pipeta e o chorume para resuspensar os PIBs. Transfira 20 microliters do chorume para um tubo de 1,5 mililitro contendo 0,5 mililitros de tampão de lise. Gire os tubos a 376 vezes g por 30 segundos.Cada tubo contém volumes iguais de PIBs nele. Descarte o supernascer, deixando apenas a resina sólida e até 50 microliters de tampão de lise em cada tubo. Transfira os lises para os tubos devidamente rotulados que contenham PIBs.Incubar o lysate com os PIBs por uma hora a 4 graus Celsius com rotação a 8 rpm. Após a incubação com o lise, centrifugar os PIBs a 376 vezes g por 30 segundos a 4 graus Celsius e remover o supernante. Lave as contas adicionando 0,5 mililitros de tampão de lise e invertendo os tubos Cole as contas por centrifugação e remova o sobrenatário.Repita esta etapa para um total de três lavagens. Após a lavagem final, remova o tampão de lise o máximo possível sem encanar os PIBs. Prepare o buffer de eluição contendo SDS de 2%e adicione o buffer de eluição de quatro a cinco vezes o volume de PIBs.Incubar a 65 graus Celsius por uma hora para elutar as fosfafefinas fosfoproteínas das contas. Centrifugar os tubos a 376 vezes g por 30 segundos à temperatura ambiente. Colete o elunato em um tubo separado e prossiga para análises de espectrometria de massa ou manchas ocidentais.Para regenerar os PIBs, incuba-os em solução 2%SDS com rotação a 8 rpm por uma hora em temperatura ambiente. Lave as contas três a cinco vezes em 25 mililitros Tris-HCl pH 7.5 com rotação por 30 minutos por lavagem. Armazene PIBs em 25 milimerlares Tris HCL pH 7.5 com azida de sódio.Para análise de espectrometria de massa, os métodos de filtragem e análise de dados variam e podem ser realizados pelo pesquisador ou por uma instalação central. Depois de pesquisar os dados brutos em um banco de dados proteome específico para espécies, filtrar os resultados de pesquisa e exportá-los como uma planilha do Microsoft Excel. Analise os dados em triplicados.Para quantificação sem rótulos, use medições de área de pico MS1 para quantificar os dados. Para identificar subunidades PPP e seus interactdores de novo, compare triplicados biológicos de amostras inibidas por microcistina-LR e tratadas com DMSO. Filtre os dados para que apenas proteínas com uma contagem total de peptídeos de mais de uma em pelo menos duas das três amostras tratadas com controle DMSO estejam presentes.Para filtrar proteínas que não se ligam especificamente à resina, remova as proteínas nas quais a contagem total de peptídeos na condição tratada com microcistina-LR é maior do que a de qualquer subunidade catalítica PPP. Exclua contaminantes comuns como queratina, colágeno, proteínas ribossômicas e ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas da análise. Um arquivo CSV é essencial para importar os dados para Perseus.Importe dados filtrados em Perseus clicando no upload de matriz genérica na seção Carregar. Transforme os dados indo para o Basic Transform, selecionando os dados e especificando a função de transformação como base de registro 2 de x. Imputar valores perdidos de uma distribuição normal indo para a imputação, Substitua os valores ausentes da distribuição normal, selecionando os dados e especificando a largura e o downshift para o cálculo.Realize a normalização quântica indo para Normalizar, normalização quântica. Anote os dados indo para linhas de anotações, linhas de anotação categóricas. Realize o teste T do aluno indo a Testes, Testes de duas amostras, selecionando os grupos, o teste a ser realizado e o método para correção de teste de hipóteses múltiplas, conforme usado para truncação.Esta função também calcula as razões de log 2. Fosfotatos fosfotínicos e seus interagedores foram identificados nas células HeLa usando um experimento de retirada do PIB, seguido por quantificação sem rótulos de abundância de proteínas em amostras tratadas com DMSO e microcistina-LR. O enredo vulcânico da análise de espectrometria de massa identificou aglutinantes PIB específicos mostrados em subunidades vermelhas, catalíticas em azul, e novas subunidades PPP candidatas, ou proteínas interagindo, em branco.As pastas não específicas foram mostradas em cinza. O gráfico de dispersão da área de log2 da célula HeLa tratada pelo DMSO mostrou que as abundâncias estavam altamente correlacionadas, indicando a reprodutibilidade dos dados. A análise de rede de todas as subunidades fosfarprotetases de fosforproteína e proteínas interativas mostrou que essas proteínas eram interagidores específicos na retirada do PIB.Análises de proteômica global poderiam ser realizadas e os resultados comparados com a análise do PIB para determinar se a composição do PPPome é impulsionada pela abundância de PPP ou regulada por mecanismos pós-translacionais. PIB-MS é uma ferramenta amplamente aplicável que nos permitiu identificar diferenças nos padrões de expressão de PPP em várias condições, como interfase versus amostras mitóticas ou diferenças entre as linhas celulares cancerosas.

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SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...