Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. признает поддержку со стороны NIH R33 CA225458 и R35 GM119455. Мы благодарим лаборатории Кеттенбаха и Гербера за их полезную дискуссию.

ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация PIB осуществляется так, как описано Moorhead et al., где 1 мг микроцистина и около 6 мл сефарозы соединены с образованием PIB с связывающей способностью до 5 мг/мл17.
1. Пробоподготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное начальное количеств?...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS - это химический протеомический подход, используемый для количественного профилирования PPPome из различных источников образцов в одном анализе. Большая работа была проделана с использованием шариков ингибитора киназы для изучения кинома и того, как он изменяется при раке и других б?...

Фосфорилирование белка контролирует большинство клеточных процессов, включая, но не ограничиваясь, реакцией на повреждение ДНК, передачей сигналов фактора роста и прохождением через митоз 1,2,3. В клетках млекопитающих большинство белков фосфорилируются в одном или нескольких остатках серина, треонина или тирозина в какой-то момент времени, причем фосфосерины и фосфотреонины составляют примерно 98% всех участков фосфорилирования 2,3. Хотя киназы широко изучаются в клеточной сигнализации, роль ПГЧС в регуляции динамических клеточных процессов все еще вырисовывается.
Динамика фосфорилирования контролируется динамическим взаимодействием между киназами и фосфатазами. В клетках млекопитающих насчитывается более 400 протеинкиназ, которые катализируют фосфорилирование серина/треонина. Более 90% этих участков дефосфорилируются фосфопротеинфосфатазами (ППС), небольшим семейством ферментов, которое состоит из PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT и PPZ 2,3. PP1 и PP2A ответственны за большую часть дефосфосерина и фосфотреонина в клетке 2,3,4. Заметная разница в количестве между киназами и фосфатазами и отсутствие специфичности каталитических субъединиц ППС in vitro привели к убеждению, что киназы являются основным детерминантом фосфорилирования 2,3. Однако многочисленные исследования показали, что фосфатазы устанавливают субстратную специфичность за счет образования многомерных голоферментов 5,6,7,8,9. Например, PP1 представляет собой гетеродимер, который состоит из каталитической субъединицы и, в данный момент времени, одной из более чем 150 регуляторных субъединиц 6,7,8. И наоборот, PP2A представляет собой гетеротример, который образован из строительных лесов (A), регулятора (B) и каталитической (C) субъединицы 2,3,9. Существует четыре различных семейства регуляторных субъединиц PP2A (B55, B56, PR72 и стриатин), каждое из которых имеет несколько генов, вариантов сращивания и паттернов локализации 2,3,9. Многомерный характер ПГЧС заполняет пробел в количестве киназ и каталитических субъединиц ППС. Однако это создает аналитические проблемы для изучения сигнализации ГЧП. Чтобы всесторонне проанализировать передачу сигналов ППС, крайне важно исследовать различные голоферменты в клетке или ткани. Большие успехи были достигнуты в изучении человеческого кинома благодаря использованию шариков ингибитора киназы, называемых бусинами мультиплексных ингибиторов или кинобеодами, химической протеомной стратегии, в которой ингибиторы киназы иммобилизуются на шариках, а масс-спектрометрия используется для идентификации обогащенных киназ и их интеракторов 10,11,12,13.
Мы установили аналогичный подход к изучению биологии ГЧП. Этот метод включает в себя захват аффинности каталитических субъединиц ППС с использованием шариков с иммобилизованным, неселективным ингибитором ППС, называемым микроцистином-LR (MCLR), называемым шариками ингибитора фосфатазы (PIBs)14,15. В отличие от других способов, требующих эндогенной маркировки или экспрессии экзогенных субъединиц ППС, которые могут изменять активность или локализацию белка, PIB-MS позволяет обогащать эндогенные каталитические субъединицы ППС, связанные с ними регуляторные и каркасные субъединицы, а также взаимодействующие белки (называемые PPPome) из клеток и тканей в данный момент времени или при определенных условиях обработки. MCLR ингибирует PP1, PP2A, PP4-6, PPT и PPZ в наномолярных концентрациях, что делает PIB высокоэффективными при обогащении PPPome16. Этот метод может быть масштабирован для использования на любом исходном материале от клеток до клинических образцов. Здесь мы подробно описываем использование PIB и масс-спектрометрии (PIB-MS) для эффективного захвата, идентификации и количественной оценки эндогенного PPPome и его модифицирующих состояний.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Визуальная сводка протокола PIB-MS. В эксперименте PIB-MS образцы могут быть получены в различных формах, от клеток до опухолей. Образец собирается, лизируется и гомогенизируется перед обогащением ППС. Для обогащения для ПГЧС лизат инкубируют с ПИБ с ингибитором ППС или без него, таким как MCLR. Затем ПИБ промывают, а ПГЧС элюируют в условиях денатурации. Образцы подготавливаются для масс-спектрометрического анализа путем удаления моющих средств путем обогащения белка SP3, триптического сбраживания и обессоливания. Затем образцы могут быть опционально помечены TMT перед масс-спектрометрическим анализом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
PIB-MS включает лизис и осветление клеток или тканей, инкубацию лизата с PIB, элюирование и анализ элюата с помощью подходов, основанных на вестерн-блоттинге или масс-спектрометрии (рисунок 1). Добавление свободного MCLR может быть использовано в качестве элемента управления для различения конкретных связующих PIB от неспецифических интеракторов. Для большинства применений подход без маркировки может быть использован для непосредственной идентификации белков в элюатах. В тех случаях, когда требуется более высокая точность количественной оценки или идентификация видов с низкой численностью, для увеличения охвата и уменьшения вводимых ресурсов может использоваться дальнейшая обработка с помощью маркировки тандемной массы (ТМТ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

Большинство клеточных процессов регулируются динамическим фосфорилированием белка. Более трех четвертей белков фосфорилируются, а фосфопротеинфосфатазы (ППС) координируют более 90% всего клеточного серо/треонина дефосфорилирования. Дерегуляция фосфорилирования белка была вовлечена в патофизиологию различных заболеваний, включая рак и нейродегенерацию. Несмотря на широкую активность, молекулярные механизмы, контролирующие ПГЧС, и механизмы, контролируемые ПГЧС, плохо характеризуются. Здесь описан протеомный подход, называемый шариками ингибитора фосфатазы и масс-спектрометрией (PIB-MS), для идентификации и количественной оценки ППС, их посттрансляционных модификаций и их интеракторов всего за 12 ч с использованием любой клеточной линии или ткани. PIB-MS использует неселективный ингибитор PPP, микроцистин-LR (MCLR), иммобилизованный на шариках сефарозы для захвата и обогащения эндогенных PPP и связанных с ними белков (называемых PPPome). Этот метод не требует экзогенной экспрессии помеченных версий PPP или использования специфических антител. PIB-MS предлагает инновационный способ изучения эволюционно сохраненных ГЧП и расширения нашего нынешнего понимания сигнализации дефосфорилирования.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Рисунок 2: Идентификация специфических связующих PIB. (A) Различные типы тканей или клеток могут быть проанализированы с помощью PIB-MS. Клетки HeLa в биологическом трипликате л?...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Здесь мы представляем протокол обогащения эндогенных фосфопротеинфосфатаз и их взаимодействующих белков из клеток и тканей, а также их идентификацию и количественную оценку с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрический подход к идентификации фосфопротеинфосфатаз и их интеракторов

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS - это новый метод, используемый для обогащения эндогенных фосфорпротеинфосфатаз, и они взаимодействуют с белками из клеток и тканей. Он включает в себя идентификацию и количественную оценку этих белков с использованием протеомики на основе масс-спектрометрии. Этот метод не требует экзогенной экспрессии меченых версий фосфорпротеинфосфатаз, которые могут изменить активность или локализацию белка.Кроме того, он не использует антитела, которые могут быть неспецифическими или неспособными различать конкретные изоформы. Этот метод исследования PPPM может быть масштабирован для использования на всем, от клеток до клинических образцов. Для начала соберите ячейку гранулы методом центрифугирования в 277 раз г в течение двух минут при комнатной температуре.Удалите среду и промыть клетки пятью миллилитрами PBS. Подготовьте буфер лизиса, как описано в текстовом протоколе, и держите на льду. Добавьте один миллилитр охлажденного буфера лизиса к образцам, затем гомогенизируйте образцы путем сонификации и удерживайте клетки на льду между импульсами.Переложить лизаты в свежие 1,5-миллилитровые пробирки. Центрифугируйте обработанный ультразвуком образец в 21, 130 раз в г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Используйте аликвоту лизата для количественной оценки общей концентрации белка с использованием анализа бицинхониновой кислоты.Этот шаг необходим для обеспечения равной концентрации белка в каждом образце. Для контроля ингибитора фосфопротеинфосфатазы подготовьте для каждого образца две аликвоты равной концентрации белка. Буфер лизиса может быть использован для разбавления образцов таким образом, чтобы каждая трубка имела одинаковую концентрацию белка.Добавьте один микромоляр свободного микроцистина-LR к одной аликвоте и равный объем ДМСО к другой. Вращайте образцы и высиживайте их на льду в течение 15 минут. Приготовление шариков ингибитора фосфатазы следует проводить заранее или во время этапов инкубации, описанных в разделе пробоподготовки.Используйте 10 микролитров твердых шариков ингибитора фосфатазы или смолы PIB для одного миллиграмма белка и добавьте их в 1,5-миллилитровую трубку. Промыть PIB трижды с 0,5 миллилитрами буфера лизиса путем вихря с последующим центрифугированием в 376 раз в g в течение 30 секунд при комнатной температуре. Добавьте соответствующее количество буфера лизиса к промытым PIB, чтобы получить 50% по объему буферного раствора PIB.Смешайте, аккуратно пипетировав и закрутив наконечник пипетки и суспензию, чтобы повторно суспендировать PIB. Переложите 20 микролитров суспензии в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 0,5 миллилитра лизисного буфера. Вращайте трубки в 376 раз в течение 30 секунд.Каждая трубка содержит равные объемы ПИБов. Выбросьте супернатант, оставив только твердую смолу и до 50 микролитров лизисного буфера в каждой пробирке. Перенесите лизаты в соответствующие маркированные пробирки, содержащие PIB.Инкубируйте лизат с PIB в течение одного часа при 4 градусах Цельсия с вращением при 8 оборотах в минуту. После инкубации с лизатом центрифугируют PIB в 376 раз г в течение 30 секунд при 4 градусах Цельсия и удаляют супернатант. Вымойте шарики, добавив 0,5 миллилитра буфера лизиса и перевернув трубки Соберите шарики путем центрифугирования и удалите супернатант.Повторите этот шаг в общей сложности для трех стирок. После окончательной промывки удалите буфер лизиса как можно больше, не пипетируя PIB. Подготовьте буфер элюирования, содержащий 2%SDS, и добавьте буфер элюирования, в четыре-пять раз превышающий объем PIB.Инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы элюдировать фосфопротеинфосфатазы из шариков. Центрифугируйте пробирки по 376 раз в г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Соберите элюат в отдельную трубку и приступайте к масс-спектрометрическому анализу или вестерн-блоттингу.Для регенерации ПИБ инкубируют их в 2%-ном растворе SDS с вращением при 8 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. Вымойте шарики три-пять раз в 25 миллимолярах Tris-HCl pH 7,5 с ротацией в течение 30 минут за одну стирку. Хранить PIBs в 25 миллимолярах Tris HCL pH 7,5 с азидом натрия.Для масс-спектрометрического анализа методы фильтрации и анализа данных различаются и могут выполняться исследователем или основным объектом. После поиска необработанных данных в базе данных протеомов для конкретных видов отфильтруйте результаты поиска и экспортируйте их в виде листа Microsoft Excel. Анализируйте данные в трех экземплярах.Для количественной оценки без маркировки используйте измерения пиковой области MS1 для количественной оценки данных. Чтобы идентифицировать субъединицы ППС и их интеракторы de novo, сравните биологические трипликаты образцов, ингибированных микроцистином-LR и обработанных ДМСО. Отфильтруйте данные таким образом, чтобы присутствовали только белки с общим количеством пептидов более одного по меньшей мере из двух из трех образцов, обработанных контролем ДМСО.Чтобы отфильтровать белки, которые неспецифически связываются со смолой, удалите белки, в которых общее количество пептидов в состоянии, обработанном микроцистином-LR, выше, чем для любой каталитической субъединицы ППС. Исключите из анализа распространенные загрязняющие вещества, такие как кератин, коллаген, рибосомные белки и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины. CSV-файл необходим для импорта данных в Perseus.Импортируйте отфильтрованные данные в Perseus, щелкнув Загрузка универсальной матрицы в разделе Загрузка. Преобразуйте данные, перейдя в раздел Базовое преобразование, выбрав данные и указав функцию преобразования в качестве базы журнала 2 из x. Вменение отсутствующих значений из нормального распределения путем перехода в раздел Условное исчисление, Замена отсутствующих значений из нормального распределения, выбор данных и указание ширины и пониженной передачи для вычисления.Выполните квантильную нормализацию, перейдя в Нормализацию, Квантильную нормализацию. Аннотируйте данные, перейдя в строки Annot, Строки категориальной аннотации. Выполните Т-тест студента, перейдя в Тесты, Тесты с двумя образцами, выбрав группы, тест для выполнения и метод для множественной коррекции проверки гипотез, используемый для усечения.Эта функция также вычисляет логарифмические соотношения 2. Фосфопротеинфосфотаты и их интеракторы были идентифицированы в клетках HeLa с использованием эксперимента PIB с удалением PIB, за которым последовала количественная оценка содержания белка без маркировки в образцах, обработанных DMSO и микроцистином-LR. Вулканический график масс-спектрометрического анализа идентифицировал специфические связующие PIB, показанные красным цветом, каталитические субъединицы синим цветом и новые потенциальные субъединицы PPP, или взаимодействующие белки, белым.Неспецифические связующие были показаны серым цветом. Точечный график области log2 из обработанного DMSO лизата клеток HeLa показал, что обилия были сильно коррелированы, что указывает на воспроизводимость данных. Сетевой анализ всех субъединиц фосфорпротеинфосфатазы и взаимодействующих белков показал, что эти белки были специфическими интеракторами при вытягивании PIB.Можно было бы провести глобальный анализ протеомики и сравнить результаты с анализом PIB, чтобы определить, определяется ли состав PPPome численностью PPP или регулируется посттрансляционными механизмами. PIB-MS является широко применимым инструментом, который позволил нам выявить различия в паттернах экспрессии ППС в различных условиях, таких как межфазные и митотические образцы или различия между линиями раковых клеток.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Крыса метил Seq платформа для выявления эпигеномные изменения, связанные с воздействием стресса

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...