Name: a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors at JoVE.com

A.N.K. reconoce el apoyo de NIH R33 CA225458 y R35 GM119455. Agradecemos a los laboratorios Kettenbach y Gerber por su útil discusión.

NOTA: La generación de PIBs se realiza según lo descrito por Moorhead et al., donde se acoplan 1 mg de microcistina y aproximadamente 6 mL de sefarosa para generar PIBs con una capacidad de unión de hasta 5 mg / mL17.
1. Preparación de la muestra
NOTA: Una cantidad inicial típica para PIB-MS es 1 mg de proteína total por condición. Para este experimento, se utilizaron aproximadamente 2,5 x 106 células HeLa pa...

<ol>
	<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis.">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li><li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Ser/Thr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling.">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li><li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+serine/threonine+phosphatases:+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates.">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li><li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A:+A+highly+regulated+family+of+serine/threonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling.">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li><li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+promiscuity+to+precision:+protein+phosphatases+get+a+makeover.">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li><li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extended+PP1+toolkit:+designed+to+create+specificity.">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li><li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D-networking+by+mitotic+phosphatases.">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li><li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PP1+binding+code:+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity.">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li><li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer.">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors.">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li><li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors.">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li><li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer.">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li><li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia.">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).</li><li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans.">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li><li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry.">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li><li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+ser/thr+protein+phosphatases:+specificity,+use+and+common+forms+of+abuse.">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li><li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose.">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li><li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry.">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li><li>Hughes, C. S., Moggridge, S., M&#252;ller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pot,+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments.">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMT+labeling+for+the+masses:+A+robust+and+cost-efficient,+in-solution+labeling+approach.">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet:+an+open-source+MS/MS+sequence+database+search+tool.">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins.">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li></ol>

PIB-MS es un enfoque de proteómica química utilizado para perfilar cuantitativamente el PPPome de varias fuentes de muestra en un solo análisis. Se ha realizado mucho trabajo utilizando perlas inhibidoras de la quinasa para estudiar el quinasa y cómo cambia en el cáncer y otros estados de enfermedad 10,11,12,13. Sin embargo, el estudio del PPPome va a la zaga. Anticipamos que este enfoque ...

La fosforilación de proteínas controla la mayoría de los procesos celulares, incluyendo pero no limitado a la respuesta al daño del ADN, la señalización del factor de crecimiento y el paso a través de la mitosis 1,2,3. En las células de mamíferos, la mayoría de las proteínas se fosforilan en uno o más residuos de serina, treonina o tirosina en algún momento, con fosfoserinas y fosfotreoninas que comprenden aproximadamente el 98% de todos los sitios de fosforilación 2,3. Si bien las quinasas se han estudiado ampliamente en la señalización celular, el papel de las APP en la regulación de los procesos celulares dinámicos aún está emergiendo.
La dinámica de fosforilación está controlada por la interacción dinámica entre las quinasas y las fosfatasas. En las células de mamíferos, hay más de 400 proteínas quinasas que catalizan la fosforilación de serina/treonina. Más del 90% de estos sitios están desfosforilados por fosfoproteínas fosfatasas (APP), una pequeña familia de enzimas que consiste en PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT y PPZ 2,3. PP1 y PP2A son responsables de la mayoría de la desfosforilación de fosfoserina y fosfotreonina dentro de una célula 2,3,4. La notable diferencia de número entre quinasas y fosfatasas y la falta de especificidad de las subunidades catalíticas de PPP in vitro llevaron a la creencia de que las quinasas son el principal determinante de la fosforilación 2,3. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que las fosfatasas establecen la especificidad del sustrato a través de la formación de holoenzimas multiméricas 5,6,7,8,9. Por ejemplo, PP1 es un heterodímero que consiste en una subunidad catalítica y, en un momento dado, una de las más de 150 subunidades reguladoras 6,7,8. Por el contrario, PP2A es un heterotrímero que está formado por un andamio (A), un regulador (B) y una subunidad catalítica (C) 2,3,9. Hay cuatro familias distintas de subunidades reguladoras de PP2A (B55, B56, PR72 y estriatina), cada una con múltiples genes, variantes de empalme y patrones de localización 2,3,9. La naturaleza multimérica de las APP llena el vacío en el número de quinasas y subunidades catalíticas de PPP. Sin embargo, crea desafíos analíticos para estudiar la señalización de PPP. Para analizar exhaustivamente la señalización de PPP, es fundamental investigar las diversas holoenzimas dentro de una célula o tejido. Se han logrado grandes avances en el estudio del quinasmo humano mediante el uso de perlas inhibidoras de la quinasa, denominadas perlas inhibidoras multiplex o quinabiadas, una estrategia proteómica química donde los inhibidores de la quinasa se inmovilizan en perlas y se utiliza la espectrometría de masas para identificar quinasas enriquecidas y sus interactores 10,11,12,13.
Hemos establecido un enfoque similar para estudiar la biología de la PPP. Esta técnica consiste en la captura por afinidad de subunidades catalíticas de PPP utilizando perlas con un inhibidor de PPP inmovilizado y no selectivo llamado microcistina-LR (MCLR) denominado perlas inhibidoras de la fosfatasa (PIBs)14,15. A diferencia de otros métodos que requieren el etiquetado endógeno o la expresión de subunidades exógenas de PPP que podrían alterar la actividad o localización de proteínas, PIB-MS permite el enriquecimiento de subunidades catalíticas endógenas de PPP, sus subunidades reguladoras y de andamiaje asociadas, y proteínas que interactúan (denominadas PPPome) de células y tejidos en un punto de tiempo dado o bajo condiciones de tratamiento específicas. MCLR inhibe PP1, PP2A, PP4-6, PPT y PPZ a concentraciones nanomolares, lo que hace que los PIB sean altamente efectivos para enriquecer el PPPome16. Este método se puede escalar para su uso en cualquier material de partida, desde células hasta muestras clínicas. Aquí, describimos en detalle el uso de PIBs y espectrometría de masas (PIB-MS) para capturar, identificar y cuantificar eficientemente el PPPome endógeno y sus estados de modificación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> Figura 1: Resumen visual del protocolo PIB-MS. En un experimento PIB-MS, se pueden obtener muestras en varias formas, desde células hasta tumores. La muestra se recoge, se lisa y homogeneiza antes del enriquecimiento con PPP. Para enriquecer para las APP, el lisado se incuba con PIBs con o sin un inhibidor de PPP, como MCLR. Los PIB se lavan y las APP se eluyen en condiciones de desnaturalización. Las muestras se preparan para el análisis de espectrometría de masas mediante la eliminación de detergentes a través del enriquecimiento de proteínas SP3, la digestión tríptica y la desalinización. Las muestras pueden ser opcionalmente marcadas con TMT antes del análisis de espectrometría de masas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
PIB-MS implica lisis y clarificación de células o tejidos, incubación del lisado con PIBs, elución y análisis del eluido a través de western blotting o enfoques basados en espectrometría de masas (Figura 1). La adición de MCLR libre se puede utilizar como un control para distinguir aglutinantes ESPECÍFICOS de PIB de interactores no específicos. Para la mayoría de las aplicaciones, se puede utilizar un enfoque sin etiquetas para identificar directamente las proteínas en los eluidos. En los casos en que se necesita una mayor precisión en la cuantificación o la identificación de especies de baja abundancia, se puede utilizar un procesamiento adicional con etiquetado de etiqueta de masa en tándem (TMT) para aumentar la cobertura y disminuir la entrada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-100ML</td>
			<td>CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410991000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5810 R 15 amp version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Fisherbrand Pellet Pestles</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk, C18</td>
			<td>CDS Analytical</td>
			<td>76333-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction plate manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT097944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic blunt end needle and plunger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generic magnetic separation rack</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH3028</td>
			<td>CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine solution 50% (wt/vol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, 65 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>model no. 1380FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koptec Pure Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol for HPLC (MeOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td>CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR (MCLR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10007188</td>
			<td>CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1&#215; without calcium and magnesium, pH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIBs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491504</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491555</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491539</td>
			<td>CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail III</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P50700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>8 rpm rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample collection plate, 96- well, 1 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0299-1</td>
			<td>CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S27110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td>
			<td></td>
			<td>model no. SFX 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE C18 desalting plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001828BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>6.51521E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>model no. 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &#215; 0.8 mg per tag</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>T6508-25ML</td>
			<td>CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge and vapor trap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer (Vortex-Genie 2)</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>LC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based approach to identify phosphoprotein phosphatases and their interactors

La mayoría de los procesos celulares están regulados por la fosforilación dinámica de proteínas. Más de tres cuartas partes de las proteínas están fosforiladas, y las fosfoproteínas fosfatasas (APP) coordinan más del 90% de toda la desfosforilación celular de serina/treonina. La desregulación de la fosforilación de proteínas se ha implicado en la fisiopatología de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer y la neurodegeneración. A pesar de su actividad generalizada, los mecanismos moleculares que controlan las APP y los controlados por las APP están mal caracterizados. Aquí, se describe un enfoque proteómico denominado perlas inhibidoras de la fosfatasa y espectrometría de masas (PIB-MS) para identificar y cuantificar las APP, sus modificaciones posttraduccionales y sus interactores en tan solo 12 h utilizando cualquier línea celular o tejido. PIB-MS utiliza un inhibidor de PPP no selectivo, microcistina-LR (MCLR), inmovilizado en perlas de sefarosa para capturar y enriquecer ppp endógenos y sus proteínas asociadas (denominado PPPome). Este método no requiere la expresión exógena de versiones etiquetadas de PPP ni el uso de anticuerpos específicos. PIB-MS ofrece una forma innovadora de estudiar las APP conservadas evolutivamente y ampliar nuestra comprensión actual de la señalización de desfosforilación.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> Figura 2: Identificación de aglutinantes piBs específicos. (A) Se puede analizar una variedad de tipos de tejidos o células a través de PIB-MS. Las células HeLa en triplicado biológico fueron tratadas con DMSO o el inhibidor de PPP MCLR, incubadas con PIBs, y analizadas a través de LC-MS / MS. (B...

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A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS es una técnica novedosa utilizada para enriquecer fosfoproteínas fosfogénicas fosfatasas y están interactuando proteínas de células y tejidos. Implica la identificación y cuantificación de estas proteínas utilizando proteómica basada en espectrometría de masas. Esta técnica no requiere la expresión exógena de versiones marcadas de fosfoproteína fosfatasas que podrían alterar la actividad o localización de las proteínas.Además, no utiliza anticuerpos que podrían ser inespecíficos o incapaces de distinguir entre isoformas específicas. Este método para investigar el PPPM se puede escalar para su uso en todo, desde células hasta muestras clínicas. Para comenzar, recolecte el pellet celular por centrifugación a 277 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente.Retire los medios y lave las células con cinco mililitros de PBS. Prepare el búfer de lisis como se describe en el protocolo de texto y manténgalo en hielo. Agregue un mililitro de tampón de lisis refrigerado a las muestras, luego homogeneice las muestras mediante sonificación y mantenga las células en hielo entre pulsos.Transfiera los lisados a tubos frescos de 1,5 mililitros. Centrifugar la muestra sonicada a 21, 130 veces g durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Use una alícuota del lisado para cuantificar la concentración total de proteínas utilizando un ensayo de ácido bicinconínico.Este paso es esencial para asegurar la misma concentración de proteínas en cada muestra. Para un control de inhibidores de la fosfoproteína fosfatasa, prepare dos alícuotas de igual concentración de proteínas para cada muestra. El tampón de lisis se puede utilizar para diluir las muestras de modo que cada tubo tenga la misma concentración de proteínas.Agregue un micromolar de microcistina-LR libre a una alícuota y un volumen igual de DMSO a la otra. Vórtice las muestras e incube en hielo durante 15 minutos. La preparación de las perlas inhibidoras de la fosfatasa debe llevarse a cabo con anticipación o durante las etapas de incubación descritas en la sección de preparación de la muestra.Use 10 microlitros de perlas inhibidoras sólidas de fosfatasa, o resina PIB, para un miligramo de proteína y agréguelos a un tubo de 1.5 mililitros. Lave los PIB tres veces con 0,5 mililitros de tampón de lisis mediante vórtice seguido de centrifugación a 376 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Agregue una cantidad adecuada de tampón de lisis a los PIB lavados para obtener una solución tampón PIB al 50% por volumen.Mezcle canalizando suavemente y gire la punta de la pipeta y la suspensión para volver a suspender los PIB. Transfiera 20 microlitros de la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 0,5 mililitros de tampón de lisis. Gire los tubos a 376 veces g durante 30 segundos.Cada tubo contiene volúmenes iguales de PIBs en él. Deseche el sobrenadante dejando solo la resina sólida y hasta 50 microlitros de tampón de lisis en cada tubo. Transfiera los lisados a los tubos debidamente etiquetados que contengan PIBs.Incubar el lisado con los PIBs durante una hora a 4 grados centígrados con rotación a 8 rpm. Después de la incubación con el lisado, centrifugue los PIB a 376 veces g durante 30 segundos a 4 grados centígrados y retire el sobrenadante. Lave las perlas añadiendo 0,5 mililitros de tampón de lisis e invirtiendo los tubos Recoja las perlas por centrifugación y retire el sobrenadante.Repita este paso para un total de tres lavados. Después del lavado final, retire el tampón de lisis tanto como sea posible sin pipetear los PIB. Prepare un búfer de elución que contenga 2% SDS y agregue el búfer de elución de cuatro a cinco veces el volumen de los SIP.Incubar a 65 grados centígrados durante una hora para eluir las fosfoproteína fosfatasas de las perlas. Centrifugar los tubos a 376 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Recoja el eluido en un tubo separado y proceda a los análisis de espectrometría de masas o western blotting.Para regenerar los PIB, incube en una solución 2%SDS con rotación a 8 rpm durante una hora a temperatura ambiente. Lave las perlas de tres a cinco veces en Tris-HCl 25 milimolares con pH 7.5 con rotación durante 30 minutos por lavado. Almacene los PIBs en 25 milimolares Tris HCL pH 7.5 con azida de sodio.Para el análisis de espectrometría de masas, los métodos de filtrado y análisis de datos varían y pueden ser realizados por el investigador o una instalación central. Después de buscar los datos sin procesar en una base de datos de proteoma específica de la especie, filtre los resultados de la búsqueda y expórtelos como una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Analizar los datos por triplicados.Para la cuantificación sin etiquetas, utilice las mediciones del área pico MS1 para cuantificar los datos. Para identificar las subunidades de PPP y sus interactores de novo, compare los triplicados biológicos de muestras inhibidas por microcistina-LR y tratadas con DMSO. Filtre los datos de modo que solo estén presentes proteínas con un recuento total de péptidos de más de una de al menos dos de las tres muestras tratadas con control DMSO.Para filtrar las proteínas que no se unen específicamente a la resina, elimine las proteínas en las que el recuento total de péptidos en la condición tratada con microcistina-LR es mayor que el de cualquier subunidad catalítica de PPP. Excluir del análisis los contaminantes comunes como la queratina, el colágeno, las proteínas ribosómicas y las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas. Un archivo CSV es esencial para importar los datos a Perseo.Importe datos filtrados en Perseo haciendo clic en Carga de matriz genérica en la sección Cargar. Transforme los datos yendo a Transformación básica, seleccionando los datos y especificando la función de transformación como log base 2 de x. Impute los valores faltantes de una distribución normal yendo a Imputación, Reemplace los valores faltantes de la distribución normal, seleccionando los datos y especificando el ancho y el desplazamiento descendente para el cálculo.Realizar normalización cuantil yendo a Normalizar, Normalización cuantil. Anote los datos yendo a Filas de anotaciones, filas de anotaciones categóricas. Realice la prueba T del estudiante yendo a Pruebas, Pruebas de dos muestras, seleccionando los grupos, la prueba a realizar y el método para la corrección de pruebas de hipótesis múltiples como se usa para el truncamiento.Esta función también calcula las proporciones log 2. Los fosfostatatos de fosfoproteína y sus interactores se identificaron en las células HeLa utilizando un experimento de extracción de PIB, seguido de una cuantificación sin etiqueta de la abundancia de proteínas en muestras tratadas con DMSO y microcistina-LR. La gráfica del volcán del análisis de espectrometría de masas identificó aglutinantes específicos de PIB que se muestran en rojo, subunidades catalíticas en azul y nuevas subunidades candidatas de PPP, o proteínas que interactúan, en blanco.Los aglutinantes inespecíficos se mostraron en gris. El diagrama de dispersión del área log2 del lisado de células HeLa tratado con DMSO mostró que las abundancias estaban altamente correlacionadas, lo que indica la reproducibilidad de los datos. El análisis de red de todas las subunidades de fosfoproteína fosfostatasa y proteínas que interactúan mostró que estas proteínas eran interactores específicos en el pull-down de PIB.Se podrían realizar análisis proteómicos globales y comparar los resultados con el análisis PIB para determinar si la composición de PPPome está impulsada por la abundancia de PPP o regulada por mecanismos post-traduccionales. PIB-MS es una herramienta ampliamente aplicable que nos ha permitido identificar diferencias en los patrones de expresión de PPP en diversas condiciones, como muestras interfase versus mitóticas o diferencias entre líneas celulares de cáncer.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Una plataforma de metil-Seq de rata para identificar cambios epigenéticos asociados a la exposición de estrés

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...