Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية صندوق الابتكار (رمز المشروع رقم. CI2021A03404) والصندوق الوطني للابتكار متعدد التخصصات في الطب الصيني التقليدي (رمز المشروع رقم. ZYYCXTD-D-202202).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والكى ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الرقم المرجعي D2018-04-13-1). وأجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن العاصمة، 1996). تم استخ...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

تقدم هذه الدراسة عرضا مفصلا للألياف العصبية الجلدية في الجلد المشعر واللامع باستخدام التألق المناعي على أقسام الأنسجة السميكة مع علاج واضح وعرض 3D لفهم تعصيب الجلد بشكل أفضل. وقت حضانة الأجسام المضادة يصل إلى 1-2 أيام وعملية التنظيف بين عشية وضحاها مهمة. تؤثر هاتان الخطوتان الرئيسيتان بشكل...

الجلد ، أكبر عضو في الجسم ، بمثابة واجهة رئيسية للبيئة ، يتم تعصيبه بكثافة من قبل العديد من الألياف العصبية1،2،3. على الرغم من أن تعصيب الجلد قد تمت دراسته على نطاق واسع سابقا باستخدام طرق نسيجية مختلفة ، مثل التلطيخ على أقسام الجلد والأنسجة الكاملة4،5،6 ، إلا أن العرض الفعال المفصل للألياف العصبية الجلدية لا يزال يمثل تحديا7،8. وبالنظر إلى ذلك، طور البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لإظهار الألياف العصبية الجلدية بشكل أكثر وضوحا في قسم الأنسجة السميكة.
بسبب الحد الأقصى لسمك الأقسام ، فإن مراقبة الألياف العصبية الجلدية المعصوبة ليست دقيقة بما يكفي لتصوير العلاقة بين الألياف العصبية للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والأنسجة والأعضاء المحلية بدقة من معلومات الصورة المكتسبة. يوفر ظهور تقنية إزالة الأنسجة ثلاثية الأبعاد طريقة مجدية لحل هذه المشكلة 9,10. قدم التطور السريع لنهج تطهير الأنسجة العديد من الأدوات لدراسة هياكل الأنسجة والأعضاء بأكملها والإسقاطات العصبية والحيوانات الكاملة في الآونة الأخيرة11. يمكن تصوير أنسجة الجلد الشفافة في قسم أكثر سمكا بواسطة المجهر البؤري للحصول على البيانات اللازمة لتصور الألياف العصبية الجلدية.
في الدراسة الحالية ، تم اختيار الجلد الأخمصي والظهري للفئران الخلفية كموقعين مستهدفين للجلد المشعر والزجاجي3،4،7. لتتبع الألياف العصبية الجلدية على مسافة أطول ، تم تقطيع أنسجة الجلد بسماكة 300 ميكرومتر للتلطيخ الكيميائي المناعي والكيميائي النسيجي ، يليه علاج إزالة الأنسجة. تم استخدام CGRP لتسمية الألياف العصبية الحسية12,13. بالإضافة إلى ذلك ، لتسليط الضوء على الألياف العصبية الجلدية على خلفية الأنسجة ، تم استخدام phalloidin و lymphatic الأوعية البطانية hyaluronan receptor 1 (LYVE1) لتسمية الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية ، على التوالي14,15.
قدمت هذه الأساليب طريقة مباشرة يمكن تطبيقها لإظهار رؤية عالية الدقة للألياف العصبية الجلدية وأيضا لتصور العلاقة المكانية بين الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد ، والتي قد توفر المزيد من المعلومات لفهم توازن الجلد الطبيعي والتغيير الجلدي في ظل الظروف المرضية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

تعصيب الجلد هو جزء مهم من الجهاز العصبي المحيطي. على الرغم من أن دراسة الألياف العصبية الجلدية قد تقدمت بسرعة ، إلا أن معظم فهم خصائصها التوزيعية والكيميائية يأتي من تلطيخ الأنسجة الكيميائية التقليدية والكيميائية المناعية على أقسام الأنسجة الرقيقة. مع تطور تقنية إزالة الأنسجة ، أصبح من الممكن عرض الألياف العصبية الجلدية على أقسام الأنسجة الأكثر سمكا. يصف هذا البروتوكول تلطيخ الفلورسنت المتعدد على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر من الجلد الأخمصي والظهري للقدم الخلفية للفئران ، وهما موقعان نموذجيان للبشرة المشعرة والزجاجية. هنا ، يقوم الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين بتسمية الألياف العصبية الحسية ، في حين أن الفيلويدين ومستقبل الهيالورونان البطاني البطاني للأوعية اللمفاوية 1 يصنفان الأوعية الدموية واللمفاوية ، على التوالي. تحت المجهر البؤري ، تم اتباع الألياف العصبية الحسية المسماة بالكامل على مسافة أطول ، وتعمل في حزم في الطبقة الجلدية العميقة وحرة في الطبقة السطحية. ركضت هذه الألياف العصبية بالتوازي مع الأوعية الدموية أو تحيط بها ، وشكلت الأوعية اللمفاوية شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجلد المشعر والزجاجي. يوفر البروتوكول الحالي نهجا أكثر فعالية لدراسة تعصيب الجلد من الطرق التقليدية الحالية من منظور المنهجية.

بعد تلطيخ الفلورسنت الثلاثي ، تم تصنيف الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية بوضوح مع CGRP و phalloidin و LYVE1 ، على التوالي ، في الجلد المشعر و glabrous (الشكل 3,4). مع العلاج المقاصة ، يمكن تصوير الألياف العصبية الإيجابية CGRP ، والأوعية الدموية الإيجابية للفالوي?...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

حد سمك أقسام الأنسجة من الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة لإزالة الأنسجة لتصور الألياف العصبية الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي تبلغ سماكتها 300 ميكرومتر تحت المجهر البؤري.

إظهار تعصيب الجلد المشعر و Glabrous في نمط 3D باستخدام أساليب تلطيخ الفلورسنت المتعددة وإزالة الأنسجة

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

قدم بروتوكولنا طريقة مجدية لمراقبة قسم المزامنة باستخدام المجهر البؤري ، والذي يمكن أن يضمن الدقة في مراقبة الألياف العصبية. بروتوكول تنظيف الأنسجة البسيط والسهل هو الميزة الرئيسية لهذه التقنية. عملية تنظيف الأنسجة فعالة وتستغرق حوالي 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.إجراء التروية على الفئران التي تم قتلها رحيما كما هو مذكور في مخطوطة النص. استخدم مشرطا لإزالة جلد الظهرية والنعل من المخلب الخلفي. بالنسبة للعينات التي تتطلب قسما مجمدا ، قم بإصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ من الألدهيد في 0.1 PB مولي لمدة ساعتين.بعد الغسيل ، قم بتضمين أنسجة الجلد في 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية وضعها داخل صندوق الثلج للتبريد. قم بإصلاح الأنسجة المثبتة على الميكروتون الاهتزازي بالماء المثلج وقم بتقطيعها بسماكة 500 ميكرومتر في الاتجاه المستعرض. بعد التقطيع ، قم بإزالة الأغاروز من الأقسام وتخزينها في لوحة من ستة آبار مع 1x PBS.احتضان أقسام الأنسجة في محلول 2٪ triton X-100 في 1x PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ضع أقسام الأنسجة في المخزن المؤقت المانع وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل أقسام الأنسجة إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للأجسام المضادة للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP والأغنام متعددة النسيلة المضادة LYVE-1 في مخزن مؤقت للتخفيف في أنبوب الطرد المركزي الصغير.ثم تدور على الخلاط لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. اغسل أقسام المناديل مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن الغسيل. في اليوم التالي ، انقل مقاطع الأنسجة إلى المحلول المختلط الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في أنبوب طرد مركزي صغير وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية.اغسل أقسام الأنسجة في صفيحة من ستة آبار مع مخزن مؤقت للغسيل مرتين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأقسام الأنسجة في الغسيل العازل على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل مقاطع الأنسجة إلى كاشف إزالة الأنسجة وقم بتدويرها بمعدل 60 دورة في الدقيقة على الخلاط بلطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.قم بتركيب الأنسجة الشفافة على الشريحة ثم قم بتدوير الأنسجة باستخدام فاصل والتمسك بالفجوة باستخدام كاشف إزالة الأنسجة الطازجة وغطاء الانزلاق. أظهر نمط 3D أن الألياف العصبية الإيجابية CGRP مرت عبر الأنسجة والأدمة تحت الجلد إلى البشرة. ركضت هذه الألياف العصبية في حزم في الأنسجة تحت الجلد المتفرعة داخل الأدمة وانتهت في البشرة.في المقابل ، يتم توزيع الفيلويدين في الأوعية الدموية الإيجابية والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE-1 في الأنسجة تحت الجلد والأدمة. بشكل عام ، ركضت الألياف العصبية الإيجابية CGRP بالتوازي مع أو تحيط بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية التي تشكل شبكة 3D في الجلد المشعر والزجاجي. مع النهج التقليدي ، على الرغم من أن الأوعية الدموية للألياف العصبية والأوعية اللمفاوية كانت موسومة بوضوح ب CGRP phalloidin و LYVE-1 في الأقسام الرقيقة ، إلا أن مراقبة هذه الهياكل كانت محدودة بسمك الشريحة ولا يمكن ملاحظتها تماما.في القسم الذي يبلغ سمكه 30 ميكرومتر ، لم يكن هناك فرق بين الجلد المشعر والجلد اللامع في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP. في أقسام الأنسجة السميكة التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر ، مقارنة بالجلد المشعر ، زادت مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP للجلد الزجاجي بشكل كبير. من المهم استخدام مخزن التنظيف العازل ذو الضغط الأسموزي العالي بعد حضانة الأجسام المضادة.عدة مرات ، من الضروري تحديد وقت التنظيف اللازم لتلطيخ التألق المناعي. بعد هذا الإجراء ، نعتقد أن هناك إمكانية لتلطيخ ومراقبة الأنسجة والأعضاء الأخرى في ستة أقسام موجودة أيضا. يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين في علم الأعصاب على مواجهة مساحة السطح وحالة الألياف العصبية.كما أنه يساعدنا على مراقبة ابتكار الأنسجة والأعضاء.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

عبر تحليل نمط مشروط متعدد المتغيرات

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

النمذجة 3D من جانبي البطينات ونسيجية توصيف الأنسجة المحيطة بالبطين في البشر والفأر

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

رواية السلبي مسح أساليب للإنتاج السريع للشفافية الضوئية في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

نموذج فأر من التعب المركزي تعديله باستخدام أسلوب منصة متعددة

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...