Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (projektkode nr. ZYYCXTD-D-202202).

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Institut for Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referencenummer D2018-04-13-1). Alle procedurer blev udført efter National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre voksne hanrotter (Sprague-Dawley, vægt 230 ± 15 g) blev anvendt i denne undersøgelse. Alle dyr blev opstaldet i en 12 timers lys/mørk cyklus med kontrolleret temperatur og fugtighed og fik fr...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Denne undersøgelse giver en detaljeret demonstration af de kutane nervefibre i den hårede og glatte hud ved at bruge immunfluorescens på tykkere vævssektioner med rydningsbehandling og en 3D-visning for at forstå hudens innervering bedre. Antistofinkubationstiden på op til 1-2 dage og en rengøringsproces natten over er vigtige. Disse to nøgletrin påvirker direkte immunfluorescensfarvningseffekten af tykke sektioner. Et yderligere problem blev rejst fra valget af antistoffer, som ikke alle er egnede til tykke sek...

Huden, det største organ i kroppen, der tjener som en vigtig grænseflade til miljøet, er tæt innerveret af mange nervefibre 1,2,3. Selvom hudindervation tidligere er blevet bredt undersøgt med forskellige histologiske metoder, såsom farvning på helmonterede hud- og vævsafsnit 4,5,6, er den detaljerede effektive demonstration af kutane nervefibre stadig en udfordring 7,8. I betragtning af dette udviklede den nuværende protokol en unik teknik til at udvise kutane nervefibre tydeligere i tykvævssektionen.
På grund af grænsen for tykkelsen af sektioner er observationen af innerverede hudnervefibre ikke præcis nok til nøjagtigt at skildre forholdet mellem calcitonin-genrelaterede peptid (CGRP) nervefibre og lokale væv og organer fra den erhvervede billedinformation. Fremkomsten af 3D-vævsrensningsteknologi giver en gennemførlig metode til at løse dette problem 9,10. Den hurtige udvikling af vævsrydningsmetoder har tilbudt mange værktøjer til undersøgelse af vævsstrukturer, hele organer, neuronale projektioner og hele dyr i nyere tid11. Det gennemsigtige hudvæv kunne afbildes i en meget tykkere sektion ved konfokal mikroskopi for at få dataene til at visualisere kutane nervefibre.
I den aktuelle undersøgelse blev plantar og dorsal hud af en rotte bagfod valgt som de to målsteder for behåret og glat hud 3,4,7. For at spore de kutane nervefibre på længere afstand blev hudvævet skåret i tykkelsen af 300 μm til immunohistokemisk og histokemisk farvning efterfulgt af vævsrensningsbehandling. CGRP blev brugt til at mærke de sensoriske nervefibre12,13. For at fremhæve de kutane nervefibre på vævsbaggrunden blev phalloidin og lymfekar endotelhyaluronanreceptor 1 (LYVE1) yderligere brugt til at mærke blodkarrene og lymfekarrene henholdsvis14,15.
Disse tilgange gav en ligetil metode, der kan anvendes til at demonstrere et højopløsningsbillede af de kutane nervefibre og også til at visualisere den rumlige sammenhæng mellem nervefibre, blodkar og lymfekar i huden, hvilket kan give meget mere information til at forstå homeostase i den normale hud og kutan ændring under de patologiske tilstande.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Hud innervering er en vigtig del af det perifere nervesystem. Selvom undersøgelsen af de kutane nervefibre har udviklet sig hurtigt, kommer det meste af forståelsen af deres fordelingsmæssige og kemiske egenskaber fra konventionel histokemisk og immunohistokemisk farvning på tynde vævssektioner. Med udviklingen af vævsrensningsteknikken er det blevet muligt at se de kutane nervefibre på tykkere vævssektioner. Denne protokol beskriver flere fluorescerende farvninger på vævssektioner i en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud af rotte bagfod, de to typiske hårede og glatte hudsteder. Her mærker det calcitonin-genrelaterede peptid de sensoriske nervefibre, mens phalloidin og lymfekarendotelhyaluronanreceptor 1 mærker henholdsvis blod- og lymfekarrene. Under et konfokalt mikroskop blev de mærkede sensoriske nervefibre fulgt fuldstændigt på længere afstand og løb i bundter i det dybe kutane lag og freestyle i det overfladiske lag. Disse nervefibre løb parallelt med eller omringede blodkarrene, og lymfekar dannede et tredimensionelt (3D) netværk i den hårede og glatte hud. Den nuværende protokol giver en mere effektiv tilgang til at studere hudindervation end de eksisterende konventionelle metoder fra metodeperspektivet.

Efter tredobbelt fluorescerende farvning blev nervefibre, blodkar og lymfekar tydeligt mærket med henholdsvis CGRP, phalloidin og LYVE1 i den hårede og glatte hud (figur 3,4). Med clearingbehandlingen kan de CGRP-positive nervefibre, phalloidin-positive blodkar og LYVE1-positive lymfekar afbildes på en større dybde for at erhverve den komplette strukturelle information om huden (figur 3). Da disse vævsstrukturer blev yderligere rekonstruere...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Tykkelsen af vævssektioner begrænsede den morfologiske undersøgelse af hudindervationen. Den nuværende protokol beskriver en unik vævsrensningsteknik til at visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vævssektioner under konfokal mikroskopi.

Demonstration af behåret og glat hudindervation i et 3D-mønster ved hjælp af flere fluorescerende farvnings- og vævsrensningsmetoder

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Vores protokol gav en mulig metode til at observere synkroniseringssektionen ved hjælp af konfokalmikroskop, som kunne sikre præcision i observationen af nervefibrene. Enkel og nem vævsrensningsprotokol er en hovedfordel ved denne teknik. Vævsrensningsprocessen er effektiv, og det tager cirka 30 minutter til en time.Udfør perfusion på den aflivede rotte som nævnt i tekstmanuskriptet. Brug en skalpel til at fjerne huden på dorsum og sål fra bagpoten. For prøver, der kræver en frossen sektion, skal vævene efterfikseres i 4% fra aldehyd i 0,1 molær PB i to timer.Efter vask skal du indlejre hudvævene i 2% agarose ved 37 grader Celsius og placere dem inde i isboksen til afkøling. Fastgør det monterede væv på den vibrerende mikrotone med isvand og skær dem i en tykkelse på 500 mikrometer i tværgående retning. Efter udskæring skal du fjerne agarosen fra sektionerne og opbevare dem i en seks brøndplade med 1x PBS.Inkuber vævssektionerne i en opløsning af 2% triton X-100 i 1x PBS natten over ved fire grader Celsius. Placer vævssektionerne i blokeringsbufferen og drej med 72 rotationer i minuttet på rysteren natten over ved fire grader Celsius. Vævssektionerne overføres til opløsningen indeholdende de primære antistoffer fra musens monoklonale anti-CGRP og får polyklonal anti-LYVE-1-antistof i fortyndingsbuffer i mikrocentrifugerøret.Drej derefter på rysteren i to dage ved fire grader Celsius. Vask vævssektionerne to gange med vaskebuffer ved stuetemperatur, og opbevar dem derefter på rysteren natten over ved fire grader Celsius i vaskebufferen. Den næste dag overføres vævssektionerne til den blandede opløsning indeholdende de sekundære antistoffer i et mikrocentrifugerør og roteres med 72 rotationer i minuttet på rysteren i fem timer ved fire grader Celsius.Vask vævssektionerne i en seksbrøndplade med vaskebuffer to gange i en time ved stuetemperatur. Hold vævssektionerne i vaskebufferen på rysteren natten over ved fire grader Celsius. Vævssektionerne overføres til vævsrensningsreagenset, og der roteres forsigtigt med 60 rotationer pr. minut på rysteren i en time ved stuetemperatur.Monter de klare væv på diaset, og cirkel derefter vævene med en afstandsstykke og sæt hullet fast med frisk vævsrensningsreagens og dækslip. 3D-mønsteret viste, at de CGRP-positive nervefibre passerede gennem det subkutane væv og dermis til epidermis. Disse nervefibre løb i bundter i det subkutane væv forgrenet i dermis og afsluttet i epidermis.I modsætning hertil fordeles phalloidin i positive blodkar og LYVE-1 positive lymfekar i det subkutane væv og dermis. Generelt løb de CGRP-positive nervefibre parallelt med eller omringede blodkarrene og lymfekarrene og dannede et 3D-netværk i den hårede og glatte hud. Med den konventionelle tilgang, selvom nervefibre blodkar og lymfekar var tydeligt mærket med CGRP phalloidin og LYVE-1 i de tynde sektioner, var observationen af disse strukturer begrænset af skivetykkelsen og kan ikke observeres fuldstændigt.I sektionen med en tykkelse på 30 mikrometer var der ingen forskel mellem behåret hud og glat hud i overfladearealet af CGRP-positive nervefibre. I de 300 mikrometer tykke vævssektioner sammenlignet med behåret hud blev overfladearealet af CGRP-positive nervefibre af glat hud signifikant forøget. Det er vigtigt at bruge rengøringsbufferen med højt osmotisk tryk efter antistofinkubation.Flere gange er den rengøringstid, der kræves til immunofluorescensfarvning, nødvendig. Efter denne procedure mener vi, at der er mulighed for farvning og observation af andre væv og organer i seks sektioner, der også findes. Denne teknik kan hjælpe neurovidenskabsforskere, der støder på overfladearealet og tilstanden af neurofibre.Det hjælper os også med at observere innovationen af væv og organer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Cross-Modal Multivariat Pattern Analysis

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D-modellering af laterale ventrikler og Histologisk karakterisering af Periventricular Tissue i mennesker og mus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse af Udvikling Tooth Kim innervation Brug Mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Elektroporation Approaches to Undersøgelse ophidselse af neuronale subpopulationer og Single-celle Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantificering af endosom og lysosommotiliteter i dyrkede neuroner ved anvendelse af fluorescerende prober

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman passiv Clearing metoder til hurtig fremstilling af optiske gennemsigtighed i hele CNS væv

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

En rotte Model af Central træthed ved hjælp af en modificeret flere Platform metode

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Imaging af fuldt aktivt hjernevæv i vågen zebrafisk larver og unge fugle ved kraniet og fjernelse af huden

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...