Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) en het Nationaal Interdisciplinair Innovatiefonds Traditionele Chinese Geneeskunde (Projectcode nr. ZYYCXTD-D-202202).

De huidige studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Instituut voor Acupunctuur en Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-04-13-1). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Drie volwassen mannelijke ratten (Sprague-Dawley, gewicht 230 ± 15 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren werden gehuisvest in een 12 uur licht/donker cyc...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

De huidige studie biedt een gedetailleerde demonstratie van de huidzenuwvezels in de behaarde en glabrous huid door immunofluorescentie te gebruiken op dikkere weefselsecties met clearingbehandeling en een 3D-weergave om de binnenkant van de huid beter te begrijpen. De antilichaamincubatietijd van maximaal 1-2 dagen en een nachtelijk reinigingsproces zijn belangrijk. Deze twee belangrijke stappen hebben direct invloed op het immunofluorescentiekleuringseffect van dikke delen. Een ander probleem werd opgeworpen door de ke...

De huid, het grootste orgaan in het lichaam, dat dient als een belangrijke interface naar de omgeving, wordt dicht geïnnerveerd door vele zenuwvezels 1,2,3. Hoewel de innervatie van de huid eerder op grote schaal is bestudeerd met verschillende histologische methoden, zoals kleuring op de huid- en weefselsecties 4,5,6, is de gedetailleerde effectieve demonstratie van huidzenuwvezels nog steeds een uitdaging 7,8. Daarom ontwikkelde het huidige protocol een unieke techniek om cutane zenuwvezels duidelijker te vertonen in het dikke weefselgedeelte.
Vanwege de limiet door de dikte van secties, is de observatie van geïnnerveerde huidzenuwvezels niet nauwkeurig genoeg om de relatie tussen calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) zenuwvezels en lokale weefsels en organen nauwkeurig weer te geven uit de verkregen beeldinformatie. De opkomst van 3D-weefselopruimingstechnologie biedt een haalbare methode om dit probleem op te lossen 9,10. De snelle ontwikkeling van weefselzuiveringsbenaderingen heeft de afgelopen tijd veel hulpmiddelen geboden voor het bestuderen van weefselstructuren, hele organen, neuronale projecties en hele dieren11. Het transparante huidweefsel kan in een veel dikker gedeelte worden afgebeeld door confocale microscopie om de gegevens te verkrijgen om huidzenuwvezels te visualiseren.
In de huidige studie werd de plantaire en dorsale huid van een rat achtervoet geselecteerd als de twee doellocaties van de harige en glabreuze huid 3,4,7. Om de huidzenuwvezels op een langere afstand te traceren, werd het huidweefsel gesneden op de dikte van 300 μm voor immunohistochemische en histochemische kleuring, gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling. CGRP werd gebruikt om de sensorische zenuwvezels12,13 te labelen. Om de huidzenuwvezels op de weefselachtergrond te benadrukken, werden falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 (LYVE1) verder gebruikt om de bloedvaten en lymfevaten te labelen, respectievelijk14,15.
Deze benaderingen leverden een eenvoudige methode op die kan worden toegepast om een hoge resolutiebeeld van de huidzenuwvezels te demonstreren en ook om de ruimtelijke correlatie tussen de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de huid te visualiseren, wat veel meer informatie kan opleveren om de homeostase van de normale huid en de cutane verandering onder de pathologische omstandigheden te begrijpen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Huid innervatie is een belangrijk onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Hoewel de studie van de huidzenuwvezels snel is gevorderd, komt het grootste deel van het begrip van hun distributieve en chemische kenmerken van conventionele histochemische en immunohistochemische kleuring op dunne weefselsecties. Met de ontwikkeling van de weefselzuiveringstechniek is het mogelijk geworden om de huidzenuwvezels op dikkere weefselsecties te bekijken. Het huidige protocol beschrijft meerdere fluorescerende kleuringen op weefselsecties met een dikte van 300 μm van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van ratten, de twee typische harige en glabreuze huidplaatsen. Hier labelt het calcitonine-gen-gerelateerde peptide de sensorische zenuwvezels, terwijl falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 respectievelijk de bloed- en lymfevaten labelen. Onder een confocale microscoop werden de gelabelde sensorische zenuwvezels volledig op langere afstand gevolgd, lopend in bundels in de diepe cutane laag en freestyle in de oppervlakkige laag. Deze zenuwvezels liepen parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten vormden een driedimensionaal (3D) netwerk in de harige en glazige huid. Het huidige protocol biedt een effectievere benadering voor het bestuderen van de innervatie van de huid dan de bestaande conventionele methoden vanuit het methodologische perspectief.

Na drievoudige fluorescerende kleuring werden de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten duidelijk gelabeld met respectievelijk CGRP, falloidine en LYVE1 in de behaarde en glabrous huid (figuur 3,4). Met de clearingbehandeling kunnen de CGRP-positieve zenuwvezels, falloidine-positieve bloedvaten en LYVE1-positieve lymfevaten op grotere diepte worden afgebeeld om de volledige structurele informatie van de huid te verkrijgen (figuur 3). Toen deze we...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Ons protocol bood een haalbare methode om de synchronisatiesectie te observeren met behulp van een confocale microscoop, die precisie kon garanderen bij de observatie van de zenuwvezels. Eenvoudig en gemakkelijk weefselreinigingsprotocol is een belangrijk voordeel van deze techniek. Het weefselreinigingsproces is efficiënt en duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.Voer perfusie uit op de geëuthanaseerde rat zoals vermeld in het tekstmanuscript. Gebruik een scalpel om de huid van de dorsum en de zool van de achterpoot te verwijderen. Voor monsters die een bevroren sectie vereisen, fixeert u de weefsels in 4% van aldehyde in 0,1 molaire PB gedurende twee uur.Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 graden Celsius en plaats ze in de ijskast voor koeling. Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoon met ijswater en snijd ze op een dikte van 500 micrometer in de transversale richting. Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zes putplaat met 1x PBS.Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% triton X-100 in 1x PBS 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rotaties per minuut op de shaker 's nachts bij vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP-anti-CGRP-antilichaam bij schapen en polyklonaal anti-LYVE-1-antilichaam bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis.Draai vervolgens twee dagen op de shaker bij vier graden Celsius. Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij vier graden Celsius in de wasbuffer. Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen in een microcentrifugebuis en roteer met 72 rotaties per minuut op de shaker gedurende vijf uur bij vier graden Celsius.Was de weefseldelen in een zes putjesplaat met wasbuffer twee keer gedurende een uur op kamertemperatuur. Bewaar de weefselsecties in wasbuffer op de shaker 's nachts op vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens en draai met 60 rotaties per minuut voorzichtig op de shaker gedurende één uur bij kamertemperatuur.Monteer de heldere weefsels op de dia en omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en afdekslip. Het 3D-patroon toonde aan dat de CGRP-positieve zenuwvezels door het onderhuidse weefsel en de dermis naar de opperhuid gingen. Deze zenuwvezels liepen in bundels in het onderhuidse weefsel vertakt in de dermis en eindigden in de opperhuid.Daarentegen worden falloïdine in positieve bloedvaten en LYVE-1 positieve lymfevaten verdeeld in het onderhuidse weefsel en de dermis. Over het algemeen liepen de CGRP-positieve zenuwvezels parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten en vormden een 3D-netwerk in de harige en glazige huid. Met de conventionele aanpak, hoewel de zenuwvezels bloedvaten en lymfevaten duidelijk werden gelabeld met CGRP-falloïdine en LYVE-1 in de dunne secties, werd de observatie van deze structuren beperkt door de plakdikte en kan deze niet volledig worden waargenomen.In het gedeelte met een dikte van 30 micrometer was er geen verschil tussen de behaarde huid en de glazige huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. In de 300 micrometer dikke weefselsecties, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid aanzienlijk toegenomen. Het is belangrijk om de reinigingsbuffer met hoge osmotische druk te gebruiken na incubatie van antilichamen.Meerdere keren is de reinigingstijd die nodig is voor de immunofluorescentiekleuring noodzakelijk. Na deze procedure geloven we dat er een mogelijkheid is van kleuring en observatie van andere weefsels en organen in zes secties. Deze techniek kan neurowetenschappelijke onderzoekers helpen om het oppervlak en de toestand van neurovezels tegen te komen.Het helpt ons ook om de innovatie van weefsels en organen te observeren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Cross-Modale Multivariate Pattern Analysis

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D modellering van de laterale ventrikels en histologische karakterisering van periventriculaire Tissue bij de mens en muis

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

Een Rat Model van Centrale vermoeidheid met een gewijzigde methode met verscheidene Platform

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...