Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Diese Studie wurde vom China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Projektcode Nr. CI2021A03404) und der National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (Projektcode-Nr. ZYYCXTD-D-202202).

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Referenznummer D2018-04-13-1). Alle Verfahren wurden nach dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklu...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Die vorliegende Studie liefert eine detaillierte Demonstration der kutanen Nervenfasern in der behaarten und kahlen Haut durch die Verwendung von Immunfluoreszenz auf dickeren Gewebeabschnitten mit Clearing-Behandlung und einer 3D-Ansicht, um die Hautinnervation besser zu verstehen. Die Antikörper-Inkubationszeit von bis zu 1-2 Tagen und ein Reinigungsprozess über Nacht sind wichtig. Diese beiden Schlüsselschritte wirken sich direkt auf die Immunfluoreszenzfärbungswirkung von dicken Abschnitten aus. Ein weiteres Prob...

Die Haut, das größte Organ im Körper, das als Schlüsselschnittstelle zur Umwelt dient, wird von vielen Nervenfasern dicht innerviert 1,2,3. Obwohl die Hautinnervation zuvor mit verschiedenen histologischen Methoden, wie der Färbung auf ganzer Haut und Gewebeabschnitten 4,5,6, umfassend untersucht wurde, ist der detaillierte effektive Nachweis von Hautnervenfasern immer noch eine Herausforderung 7,8. Vor diesem Hintergrund entwickelte das vorliegende Protokoll eine einzigartige Technik, um kutane Nervenfasern im dicken Gewebeabschnitt deutlicher darzustellen.
Aufgrund der Grenze durch die Dicke der Abschnitte ist die Beobachtung von innervierten Hautnervenfasern nicht präzise genug, um die Beziehung zwischen Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP) Nervenfasern und lokalen Geweben und Organen aus den aufgenommenen Bildinformationen genau darzustellen. Das Aufkommen der 3D-Gewebereinigungstechnologie bietet eine praktikable Methode, um dieses Problem zu lösen 9,10. Die schnelle Entwicklung von Gewebe-Clearing-Ansätzen hat in jüngster Zeit viele Werkzeuge zur Untersuchung von Gewebestrukturen, ganzen Organen, neuronalen Projektionen und ganzen Tieren angeboten11. Das transparente Hautgewebe könnte in einem viel dickeren Abschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, um die Daten zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern zu erhalten.
In der aktuellen Studie wurde die Plantar- und Rückenhaut eines Rattenhinterfußes als die beiden Zielstellen von behaarter und kahler Hautausgewählt 3,4,7. Um die Hautnervenfasern in größerer Entfernung zu verfolgen, wurde das Hautgewebe in einer Dicke von 300 μm für die immunhistochemische und histochemische Färbung geschnitten, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung. CGRP wurde verwendet, um die sensorischen Nervenfasern12,13 zu kennzeichnen. Um die kutanen Nervenfasern auf dem Gewebehintergrund hervorzuheben, wurden außerdem Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 (LYVE1) verwendet, um die Blutgefäße bzw. Lymphgefäße14,15 zu markieren.
Diese Ansätze lieferten eine einfache Methode, die angewendet werden kann, um eine hochauflösende Ansicht der kutanen Nervenfasern zu demonstrieren und auch die räumliche Korrelation zwischen den Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der Haut zu visualisieren, was viel mehr Informationen liefern kann, um die Homöostase der normalen Haut und die Hautveränderung unter den pathologischen Bedingungen zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Hautinnervation ist ein wichtiger Teil des peripheren Nervensystems. Obwohl das Studium der kutanen Nervenfasern schnell vorangekommen ist, stammt der größte Teil des Verständnisses ihrer verteilungsbedingten und chemischen Eigenschaften aus der konventionellen histochemischen und immunhistochemischen Färbung auf dünnen Gewebeschnitten. Mit der Entwicklung der Gewebereinigungstechnik ist es möglich geworden, die Hautnervenfasern auf dickeren Gewebeschnitten zu betrachten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die mehrfache fluoreszierende Färbung auf Gewebeschnitten mit einer Dicke von 300 μm aus der Plantar- und Rückenhaut von Rattenhinterfuß, den beiden typischen behaarten und kahlen Hautstellen. Hier markiert das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid die sensorischen Nervenfasern, während Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 des Lymphgefäßes die Blut- bzw. Lymphgefäße markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop wurden die markierten sensorischen Nervenfasern vollständig auf längere Distanz verfolgt, in Bündeln in der tiefen Hautschicht und Freestyle in der oberflächlichen Schicht. Diese Nervenfasern verliefen parallel zu den Blutgefäßen oder umgaben sie, und Lymphgefäße bildeten ein dreidimensionales (3D) Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Das aktuelle Protokoll bietet einen effektiveren Ansatz zur Untersuchung der Hautinnervation als die bestehenden konventionellen Methoden aus methodischer Sicht.

Nach der dreifach fluoreszierenden Färbung wurden die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in der behaarten und kahlen Haut deutlich mit CGRP, Phalloidin bzw. LYVE1 markiert (Abbildung 3,4). Mit der Clearing-Behandlung können die CGRP-positiven Nervenfasern, Phalloidin-positiven Blutgefäße und LYVE1-positiven Lymphgefäße in größerer Tiefe abgebildet werden, um die vollständige Strukturinformation der Haut zu erfassen (Abbildung 3</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.

Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Unser Protokoll bot eine praktikable Methode, um den Sync-Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, was eine Präzision bei der Beobachtung der Nervenfasern gewährleisten konnte. Ein einfaches und leichtes Tissue-Reinigungsprotokoll ist ein Hauptvorteil dieser Technik. Der Tissue-Reinigungsprozess ist effizient und dauert etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde.Führen Sie eine Perfusion an der eingeschläferten Ratte durch, wie im Textmanuskript erwähnt. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen. Für Proben, die einen gefrorenen Abschnitt erfordern, fixieren Sie das Gewebe in 4% aus Aldehyd in 0,1 molaren PB für zwei Stunden.Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 Grad Celsius in 2% Agarose ein und legen Sie sie zur Kühlung in die Eisbox. Fixieren Sie das montierte Gewebe mit Eiswasser auf dem Vibrationsmikroton und schneiden Sie es mit einer Dicke von 500 Mikrometern in Querrichtung auf. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit 1x PBS.Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE-1-Antikörpers der Schafe im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Dann zwei Tage bei vier Grad Celsius auf dem Shaker drehen. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius im Waschpuffer auf dem Shaker. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius rotieren.Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit Waschpuffer zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie sich mit 60 Umdrehungen pro Minute sanft für eine Stunde bei Raumtemperatur.Montieren Sie das klare Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie dann das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckschlitten. Das 3D-Muster zeigte, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verliefen in Bündeln im Unterhautgewebe, die innerhalb der Dermis verzweigt und in der Epidermis abgeschlossen waren.Im Gegensatz dazu sind Phalloidin in positiven Blutgefäßen und LYVE-1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt. Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen und umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Abschnitten eindeutig mit CGRP-Phalloidin und LYVE-1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen war jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden.In dem Abschnitt mit einer Dicke von 30 Mikrometern gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 Mikrometern dicken Gewebeabschnitten wurde im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert. Es ist wichtig, den Reinigungspuffer mit hohem osmotischem Druck nach der Antikörperinkubation zu verwenden.Mehrmals ist die Reinigungszeit notwendig, die für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt wird. Nach diesem Verfahren glauben wir, dass es auch eine Möglichkeit der Färbung und Beobachtung anderer Gewebe und Organe in sechs Abschnitten gibt. Diese Technik könnte neurowissenschaftlichen Forschern helfen, auf die Oberfläche und den Zustand von Neurofasern zu stoßen.Es hilft uns auch, die Innovation von Geweben und Organen zu beobachten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

Eine Ratte Modell der zentralen Ermüdung mit einem modifizierten mehrere Plattform-Methode

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...