Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הסינית לחדשנות במדעי הרפואה של סין (קוד פרויקט מס'. CI2021A03404) והקרן הלאומית הלאומית לחדשנות בין-תחומית ברפואה סינית מסורתית (קוד פרויקט מס' ZYYCXTD-D-202202).

המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ו- Moxibustion, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-04-13-1). כל ההליכים נערכו בעקבות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). במחקר זה נעשה שימוש בשלוש חולדו?...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

המחקר הנוכחי מספק הדגמה מפורטת של סיבי העצב העוריים בעור השעיר והזוהר על ידי שימוש באימונופלואורסצנציה על חלקי רקמות עבים יותר עם טיפול ניקוי ותצוגה תלת-ממדית כדי להבין טוב יותר את העצבנות של העור. זמן הדגירה של הנוגדנים של עד 1-2 ימים ותהליך ניקוי לילה חשובים. שני שלבים מרכזיים אלה משפיעים...

העור, האיבר הגדול ביותר בגוף, המשמש כממשק מפתח לסביבה, מופנם בצפיפות על ידי סיבי עצב רבים 1,2,3. למרות שעיוורון העור נחקר באופן נרחב בעבר בשיטות היסטולוגיות שונות, כגון צביעה על מקטעי עור ורקמות שלמים 4,5,6, ההדגמה היעילה המפורטת של סיבי עצב עוריים היא עדיין אתגר 7,8. בהתחשב בכך, הפרוטוקול הנוכחי פיתח טכניקה ייחודית להצגת סיבי עצב עוריים בצורה ברורה יותר בחלק הרקמה העבה.
בגלל הגבול של עובי החלקים, התצפית על סיבי עצב עור פנימיים אינה מדויקת מספיק כדי לתאר במדויק את הקשר בין סיבי עצב פפטידים הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) לבין רקמות ואיברים מקומיים ממידע התמונה שנרכש. הופעתה של טכנולוגיית ניקוי רקמות תלת-ממדית מספקת שיטה אפשרית לפתרון בעיה זו 9,10. ההתפתחות המהירה של גישות לניקוי רקמות הציעה כלים רבים לחקר מבני רקמות, איברים שלמים, הקרנות עצביות ובעלי חיים שלמים בתקופה האחרונה11. ניתן היה לדמות את רקמת העור השקופה בקטע עבה הרבה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל את הנתונים כדי לדמיין סיבי עצב עוריים.
במחקר הנוכחי, העור הכפי והגבי של כף רגל אחורית של חולדה נבחר כשני אתרי המטרה של עור שעיר וגלברוס 3,4,7. כדי להתחקות אחר סיבי העצב העוריים במרחק רב יותר, רקמת העור נחתכה בעובי של 300 מיקרומטר לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית, ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות. CGRP שימש לסימון סיבי העצב החושיים12,13. בנוסף, כדי להדגיש את סיבי העצב העוריים על רקע הרקמה, נעשה שימוש נוסף בפלואידין ובקולטן היאלורונן אנדותל לימפתי 1 (LYVE1) כדי לתייג את כלי הדם וכלי הלימפה, בהתאמה14,15.
גישות אלה סיפקו שיטה פשוטה שניתן ליישם כדי להדגים תצוגה ברזולוציה גבוהה של סיבי העצב העוריים וגם כדי לדמיין את המתאם המרחבי בין סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור, אשר עשוי לספק הרבה יותר מידע כדי להבין את ההומאוסטזיס של העור הרגיל ואת השינוי העורי בתנאים הפתולוגיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

עצבנות העור היא חלק חשוב ממערכת העצבים ההיקפית. למרות שהמחקר של סיבי העצב העוריים התקדם במהירות, רוב ההבנה של המאפיינים ההפצתיים והכימיים שלהם מגיעה מהכתמים היסטוכימיים ואימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים על חלקי רקמה דקים. עם התפתחות טכניקת ניקוי הרקמה, ניתן היה לראות את סיבי העצב העוריים על חלקי רקמה עבים יותר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כתמים פלואורסצנטיים מרובים על מקטעי רקמות בעובי של 300 מיקרומטר מהעור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה, שני אתרי העור השעירים והזוהרים האופייניים. כאן, הפפטיד הקשור לגן קלציטונין מסמן את סיבי העצב החושיים, בעוד שפלואידין וקולטן אנדותל היאלורונן אנדותל כלי הלימפה 1 מסמנים את הדם וכלי הלימפה, בהתאמה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סיבי העצב החושיים המסומנים היו במעקב מלא במרחק ארוך יותר, רצים בצרורות בשכבה העורית העמוקה ובסגנון חופשי בשכבה השטחית. סיבי עצב אלה זרמו במקביל לכלי הדם או הקיפו אותם, וכלי הלימפה יצרו רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) בעור השעיר והזוהר. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה יותר לחקר העצבנות של העור מאשר השיטות הקונבנציונליות הקיימות מנקודת המבט המתודולוגית.

לאחר צביעה פלואורסצנטית משולשת, סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1, בהתאמה, בעור השעיר והזוהר (איור 3,4). עם הטיפול המנקה, סיבי העצב החיוביים ל-CGRP, כלי הדם החיוביים לפאלואידין וכלי הלימפה החיוביים ל-LYVE1 ניתנים לדמיון בעומק רב יותר כדי לקב...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

הפרוטוקול שלנו סיפק שיטה אפשרית לתצפית על קטע הסינכרון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, שיכול היה להבטיח דיוק בתצפית על סיבי העצב. פרוטוקול ניקוי רקמות פשוט וקל הוא יתרון עיקרי של טכניקה זו. תהליך ניקוי הרקמות יעיל ולוקח כ-30 דקות עד שעה.ביצוע זלזול בחולדה המתת חסדת כפי שצוין בכתב היד של הטקסט. השתמשו באזמל כדי להסיר את עור הגב והסוליה מהכף האחורית. עבור דגימות הדורשות חתך קפוא, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% מ aldehyde ב 0.1 טוחנת PB במשך שעתיים.לאחר הכביסה, הטמיעו את רקמות העור ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והניחו אותן בתוך קופסת הקרח לקירור. קבעו את הרקמה המותקנת על המיקרוטון הרוטט במי קרח ופורסים אותם בעובי של 500 מיקרומטר בכיוון הרוחבי. לאחר החיתוך, הסר את האגרוז מהקטעים ואחסן אותם בצלחת שש באר עם 1x PBS.הדגירה של חלקי הרקמה בתמיסה של 2% טריטון X-100 ב-1x PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מכניסים את חלקי הרקמה למאגר החוסם ומסובבים ב-72 סיבובים לדקה על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. העבר את חלקי הרקמה לתוך התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של נוגדן אנטי-CGRP חד-שבטי של עכברים ונוגדן רב-שבטי נגד LYVE-1 של כבשים במאגר דילול בצינור המיקרו צנטריפוגה.לאחר מכן סובבו על השייקר במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את חלקי הרקמות פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר, ואז השאירו אותם על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במאגר הכביסה. למחרת, מעבירים את חלקי הרקמה לתמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים בצינור מיקרו צנטריפוגה ומסובבים ב-72 סיבובים לדקה על השייקר במשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס.שטפו את חלקי הרקמות בצלחת של שש בארות עם חיץ כביסה פעמיים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שמור את חלקי הרקמות במאגר שטיפה על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את חלקי הרקמה לריאגנט ניקוי הרקמה ומסובבים ב-60 סיבובים בדקה על השייקר בעדינות למשך שעה בטמפרטורת החדר.להרכיב את הרקמות השקופות על המגלשה ואז להקיף את הרקמות עם ספייסר ולהדביק את הפער עם מגיב ניקוי רקמות טריות והחלקת כיסוי. התבנית התלת-ממדית הראתה כי סיבי העצב החיוביים של CGRP עברו דרך הרקמה התת עורית והדרמיס לאפידרמיס. סיבי עצב אלה רצו בצרורות ברקמה התת עורית שהסתעפו בתוך הדרמיס והסתיימו באפידרמיס.לעומת זאת, פאלואידין בכלי דם חיוביים וכלי הלימפה החיוביים של LYVE-1 מופצים ברקמה התת עורית ובדרמיס. בדרך כלל סיבי העצב החיוביים של CGRP פעלו במקביל או הקיפו את כלי הדם וכלי הלימפה ויצרו רשת תלת-ממדית בעור השעיר והזוהר. עם הגישה הקונבנציונלית, למרות שכלי הדם של סיבי העצב וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP phalloidin ו- LYVE-1 בחלקים הדקים, התצפית על מבנים אלה הייתה מוגבלת על ידי עובי הפרוסה ולא ניתן לצפות בה לחלוטין.בקטע בעובי של 30 מיקרומטרים, לא היה הבדל בין עור שעיר לעור גלברוס באזור הפנים של סיבי עצב חיוביים של CGRP. בקטעי הרקמות העבים של 300 מיקרומטר, בהשוואה לעור שעיר, שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים CGRP של עור גלברוס הוגדל באופן משמעותי. חשוב להשתמש במאגר הניקוי בלחץ אוסמוטי גבוה לאחר דגירה של נוגדנים.מספר פעמים, יש צורך בזמן הניקוי הנדרש לצביעת אימונואורסצנציה. בעקבות הליך זה, אנו מאמינים שקיימת גם אפשרות של צביעה ותצפית של רקמות ואיברים אחרים בשישה חלקים. טכניקה זו עשויה לסייע לחוקרי מדעי המוח לפגוש את שטח הפנים ואת מצב הסיבים העצביים.זה גם עוזר לנו להתבונן בחדשנות של רקמות ואיברים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

חוצה מודאלי תבנית ניתוח רב משתני

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D דוגמנות של רוחב החדרים והיסטולוגית אפיון רקמות סביב חדרי מוח בבני אדם ועכבר

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

חולדה מודל מרכזי עייפות בעזרת ששונה שיטת פלטפורמה מרובים

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...