Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

इस अध्ययन को चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज इनोवेशन फंड (प्रोजेक्ट कोड नं. सीआई 2021 ए 03404) और राष्ट्रीय पारंपरिक चीनी चिकित्सा अंतःविषय नवाचार निधि (परियोजना कोड सं। ZYYCXTD-डी-202202)।

वर्तमान अध्ययन को एक्यूपंक्चर और मोक्सीबस्टन संस्थान, चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी (संदर्भ संख्या डी 2018-04-13-1) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेश...

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	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

वर्तमान अध्ययन समाशोधन उपचार के साथ मोटे ऊतक वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके बालों वाली और चमकदार त्वचा में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करता है और त्वचा को बेहतर ढ...

त्वचा, शरीर का सबसे बड़ा अंग, पर्यावरण के लिए एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस के रूप में सेवा करता है, कई तंत्रिका तंतुओं 1,2,3 द्वारा घनीभूत रूप से आंतरिक होता है। यद्यपि त्वचा के अंतर्वेशन का व्यापक रूप से विभिन्न हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ पहले अध्ययन किया गया है, जैसे कि पूरे माउंट त्वचा और ऊतक अनुभाग 4,5,6 पर धुंधला होना, त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का विस्तृत प्रभावी प्रदर्शन अभी भी एक चुनौती 7,8 है। यह देखते हुए, वर्तमान प्रोटोकॉल ने मोटी ऊतक अनुभाग में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को अधिक स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करने के लिए एक अनूठी तकनीक विकसित की।
वर्गों की मोटाई की सीमा के कारण, अंतर्निहित त्वचा तंत्रिका तंतुओं का अवलोकन कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) तंत्रिका तंतुओं और अधिग्रहित छवि जानकारी से स्थानीय ऊतकों और अंगों के बीच संबंधों को सटीक रूप से चित्रित करने के लिए पर्याप्त सटीक नहीं है। 3 डी ऊतक समाशोधन प्रौद्योगिकी का उद्भव इस समस्या को हल करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान करताहै 9,10। ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण के तेजी से विकास ने हाल के दिनों में ऊतक संरचनाओं, पूरे अंगों, न्यूरोनल अनुमानों और पूरे जानवरों का अध्ययन करने के लिए कई उपकरण ोंकी पेशकश की है 11. पारदर्शी त्वचा ऊतक को त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बहुत मोटे खंड में चित्रित किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, एक चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा को बालों वाली और चमकदार त्वचा 3,4,7 के दो लक्ष्य स्थलों के रूप में चुना गया था। लंबी दूरी पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का पता लगाने के लिए, त्वचा के ऊतकों को इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल धुंधला होने के लिए 300 μm की मोटाई पर काटा गया था, इसके बाद ऊतक समाशोधन उपचार किया गया था। सीजीआरपी का उपयोग संवेदी तंत्रिका तंतुओं12,13 को लेबल करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, ऊतक पृष्ठभूमि पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को उजागर करने के लिए, फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 (एलवाईवीई 1) का उपयोग क्रमशः14,15 रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया था।
इन दृष्टिकोणों ने एक सीधी विधि प्रदान की जिसे त्वचीय तंत्रिका तंतुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य को प्रदर्शित करने और त्वचा में तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के बीच स्थानिक सहसंबंध की कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो सामान्य त्वचा के होमियोस्टेसिस और रोग स्थितियों के तहत त्वचीय परिवर्तन को समझने के लिए बहुत अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

त्वचा की वृद्धि परिधीय तंत्रिका तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। यद्यपि त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का अध्ययन तेजी से आगे बढ़ा है, लेकिन उनके वितरण और रासायनिक विशेषताओं की अधिकांश समझ पतले ऊतक वर्गों पर पारंपरिक हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने से आती है। ऊतक समाशोधन तकनीक के विकास के साथ, मोटे ऊतक वर्गों पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को देखना संभव हो गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा से 300 μm की मोटाई पर ऊतक वर्गों पर कई फ्लोरोसेंट धुंधला का वर्णन करता है, दो विशिष्ट बालों वाली और चमकदार त्वचा साइटें। यहां, कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड संवेदी तंत्रिका तंतुओं को लेबल करता है, जबकि फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 क्रमशः रक्त और लसीका वाहिकाओं को लेबल करते हैं। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत, लेबल संवेदी तंत्रिका तंतुओं को पूरी तरह से लंबी दूरी पर पीछा किया गया था, गहरी त्वचीय परत में बंडलों में चल रहा था और सतही परत में फ्रीस्टाइल था। ये तंत्रिका तंतु रक्त वाहिकाओं के समानांतर या घिरे हुए थे, और लसीका वाहिकाओं ने बालों वाली और चमकदार त्वचा में एक त्रि-आयामी (3 डी) नेटवर्क का गठन किया। वर्तमान प्रोटोकॉल पद्धति परिप्रेक्ष्य से मौजूदा पारंपरिक तरीकों की तुलना में त्वचा का अध्ययन करने के लिए एक अधिक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है।

ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद, तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को स्पष्ट रूप से सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ क्रमशः बालों वाली और चमकदार त्वचा (चित्रा 3,4) म?...

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Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

ऊतक वर्गों की मोटाई ने त्वचा के रूपात्मक अध्ययन को सीमित कर दिया। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मोटी 300 μm ऊतक वर्गों में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए एक अद्वितीय ऊतक समाशोधन तकनीक का वर्णन करता है।

एकाधिक फ्लोरोसेंट धुंधला और ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण का उपयोग करके 3 डी पैटर्न में बालों वाली और चमकदार त्वचा का प्रदर्शन

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

हमारे प्रोटोकॉल ने कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सिंक अनुभाग का निरीक्षण करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान की, जो तंत्रिका तंतुओं के अवलोकन में सटीकता सुनिश्चित कर सकती है। सरल और आसान ऊतक सफाई प्रोटोकॉल इस तकनीक का एक मुख्य लाभ है। ऊतक सफाई प्रक्रिया कुशल है और इसमें लगभग 30 मिनट से एक घंटे लगते हैं।पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित इच्छामृत्यु वाले चूहे पर छिड़काव का संचालन करें। हिंद पंजा से डोरसम और एकमात्र की त्वचा को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। जमे हुए अनुभाग की आवश्यकता वाले नमूनों के लिए, दो घंटे के लिए 0.1 दाढ़ पीबी में एल्डिहाइड से 4% में ऊतकों को ठीक करें।धोने के बाद, त्वचा के ऊतकों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% एगरोज़ में एम्बेड करें और उन्हें ठंडा करने के लिए बर्फ के बक्से के अंदर रखें। बर्फ के पानी के साथ स्पंदनात्मक माइक्रोटोन पर घुड़सवार ऊतक को ठीक करें और उन्हें अनुप्रस्थ दिशा में 500 माइक्रोमीटर की मोटाई पर काट लें। टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, वर्गों से एगरोज़ को हटा दें और उन्हें 1x पीबीएस के साथ छह अच्छी तरह से प्लेट में स्टोर करें।चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1x पीबीएस में 2% ट्राइटन एक्स -100 के समाधान में ऊतक वर्गों सेते हैं। ऊतक वर्गों को अवरुद्ध बफर में रखें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर शेकर पर प्रति मिनट 72 घूर्णन पर घुमाएं। सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में कमजोर पड़ने बफर में माउस मोनोक्लोनल एंटी-सीजीआरपी और भेड़ पॉलीक्लोनल एंटी-एलवाईवीई -1 एंटीबॉडी के प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान में ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करें।फिर चार डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए शेकर पर घुमाएं। कमरे के तापमान पर धोने के बफर के साथ ऊतक वर्गों को दो बार धोएं, फिर उन्हें धोने के बफर में चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर शेकर पर रखें। अगले दिन, एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त मिश्रित समाधान में ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच घंटे के लिए शेकर पर प्रति मिनट 72 रोटेशन पर घुमाएं।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए दो बार बफर धोने के साथ छह अच्छी तरह से प्लेट में ऊतक वर्गों को धो लें। चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर शेकर पर बफर धोने में ऊतक वर्गों रखें। ऊतक समाशोधन अभिकर्मक में ऊतक वर्गों स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए धीरे से प्रकार के बरतन पर प्रति मिनट 60 घूर्णन पर बारी बारी से।स्लाइड पर स्पष्ट ऊतकों को माउंट करें फिर एक स्पेसर के साथ ऊतकों को सर्कल करें और ताजा ऊतक समाशोधन अभिकर्मक और कवर पर्ची के साथ अंतर को छड़ी करें। 3 डी पैटर्न ने प्रदर्शित किया कि सीजीआरपी सकारात्मक तंत्रिका फाइबर चमड़े के नीचे के ऊतकों और डर्मिस के माध्यम से एपिडर्मिस में पारित हो गए। ये तंत्रिका तंतु डर्मिस के भीतर शाखाओं वाले चमड़े के नीचे के ऊतकों में बंडलों में भाग गए और एपिडर्मिस में समाप्त हो गए।इसके विपरीत, सकारात्मक रक्त वाहिकाओं में फालोइडिन और एलवाईवीई -1 सकारात्मक लसीका वाहिकाओं को चमड़े के नीचे के ऊतकों और डर्मिस में वितरित किया जाता है। आम तौर पर सीजीआरपी पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर बालों वाली और चमकदार त्वचा में 3 डी नेटवर्क बनाने वाली रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के समानांतर या घिरे हुए थे। पारंपरिक दृष्टिकोण के साथ, हालांकि तंत्रिका तंतुओं रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को पतले वर्गों में सीजीआरपी फालोइडिन और एलवाईवीई -1 के साथ स्पष्ट रूप से लेबल किया गया था, इन संरचनाओं का अवलोकन टुकड़ा मोटाई द्वारा सीमित था और पूरी तरह से नहीं देखा जा सकता है।30 माइक्रोमीटर की मोटाई वाले खंड में, सीजीआरपी सकारात्मक तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में बालों वाली त्वचा और चमकदार त्वचा के बीच कोई अंतर नहीं था। बालों वाली त्वचा की तुलना में 300 माइक्रोमीटर मोटे ऊतक वर्गों में, ग्लेब्रस त्वचा के सीजीआरपी सकारात्मक तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में काफी वृद्धि हुई थी। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद उच्च आसमाटिक दबाव के साथ सफाई बफर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।कई बार, इम्यूनो प्रतिदीप्ति धुंधला के लिए आवश्यक सफाई समय आवश्यक है। इस प्रक्रिया के बाद, हम मानते हैं कि धुंधला होने की संभावना है और छह वर्गों में अन्य ऊतकों और अंगों का अवलोकन भी मौजूद है। यह तकनीक तंत्रिका विज्ञान शोधकर्ताओं को सतह क्षेत्र और न्यूरो फाइबर की स्थिति का सामना करने में सहायता कर सकती है।यह हमें ऊतकों और अंगों के नवाचार का निरीक्षण करने में भी मदद करता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

क्रॉस मॉडल बहुभिन्नरूपी पैटर्न विश्लेषण

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

ऊतक और माउस संवेदी तंत्रिका फाइबर त्वचा और अंग की हड्डी Innervating तैयार Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

मनुष्य और माउस में Periventricular ऊतक के पार्श्व ventricles और histological विशेषता के 3 डी मॉडलिंग

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Microfluidic सह संस्कृति उपकरणों का प्रयोग करना टूथ रोगाणु INNERVATION विकास का विश्लेषण

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

पूरे सीएनएस ऊतक में ऑप्टिकल पारदर्शिता के तेजी से उत्पादन के लिए उपंयास निष्क्रिय समाशोधन तरीकों

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल एक संशोधित एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म विधि का उपयोग

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

चूहा मस्तिष्क ऊतक के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...