Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Codice di progetto n. CI2021A03404) e il Fondo Nazionale per l'Innovazione Interdisciplinare di Medicina Tradizionale Cinese (Codice di Progetto n. ZYYCXTD-D-202202).

Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-04-13-1). Tutte le procedure sono state condotte seguendo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo luce/buio di 12...

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	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Il presente studio fornisce una dimostrazione dettagliata delle fibre nervose cutanee nella pelle pelosa e glabra utilizzando l'immunofluorescenza su sezioni di tessuto più spesse con trattamento di compensazione e una vista 3D per comprendere meglio l'innervazione della pelle. Il tempo di incubazione degli anticorpi fino a 1-2 giorni e un processo di pulizia notturno sono importanti. Questi due passaggi chiave influenzano direttamente l'effetto di colorazione dell'immunofluorescenza delle sezioni spesse. Un ulteriore p...

La pelle, l'organo più grande del corpo, che funge da interfaccia chiave per l'ambiente, è densamente innervata da molte fibre nervose 1,2,3. Sebbene l'innervazione cutanea sia stata ampiamente studiata in precedenza con vari metodi istologici, come la colorazione su sezioni di pelle e tessuto intero 4,5,6, la dimostrazione efficace dettagliata delle fibre nervose cutanee è ancora una sfida 7,8. Detto questo, il presente protocollo ha sviluppato una tecnica unica per esporre le fibre nervose cutanee più chiaramente nella sezione del tessuto spesso.
A causa del limite per lo spessore delle sezioni, l'osservazione delle fibre nervose della pelle innervata non è abbastanza precisa da rappresentare con precisione la relazione tra le fibre nervose del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e i tessuti e gli organi locali dalle informazioni acquisite sull'immagine. L'emergere della tecnologia di compensazione dei tessuti 3D fornisce un metodo fattibile per risolvere questo problema 9,10. Il rapido sviluppo di approcci di compensazione dei tessuti ha offerto molti strumenti per studiare le strutture tissutali, interi organi, proiezioni neuronali e interi animali negli ultimi tempi11. Il tessuto cutaneo trasparente potrebbe essere ripreso in una sezione molto più spessa al microscopio confocale per ottenere i dati per visualizzare le fibre nervose cutanee.
Nel presente studio, la pelle plantare e dorsale di un ratto posteriore è stata selezionata come i due siti bersaglio della pelle pelosa e glabra 3,4,7. Per tracciare le fibre nervose cutanee a una distanza maggiore, il tessuto cutaneo è stato tagliato allo spessore di 300 μm per la colorazione immunoistochimica e istochimica, seguita da un trattamento di pulizia dei tessuti. CGRP è stato utilizzato per etichettare le fibre nervose sensoriali12,13. Inoltre, per evidenziare le fibre nervose cutanee sullo sfondo del tessuto, la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 (LYVE1) sono stati ulteriormente utilizzati per etichettare i vasi sanguigni e i vasi linfatici, rispettivamente14,15.
Questi approcci hanno fornito un metodo semplice che può essere applicato per dimostrare una visione ad alta risoluzione delle fibre nervose cutanee e anche per visualizzare la correlazione spaziale tra le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici della pelle, che può fornire molte più informazioni per comprendere l'omeostasi della pelle normale e l'alterazione cutanea nelle condizioni patologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

L'innervazione della pelle è una parte importante del sistema nervoso periferico. Sebbene lo studio delle fibre nervose cutanee sia progredito rapidamente, la maggior parte della comprensione delle loro caratteristiche distributive e chimiche proviene dalla colorazione istochimica e immunoistochimica convenzionale su sezioni di tessuto sottile. Con lo sviluppo della tecnica di pulizia dei tessuti, è diventato possibile visualizzare le fibre nervose cutanee su sezioni di tessuto più spesse. Il presente protocollo descrive la colorazione fluorescente multipla su sezioni tissutali ad uno spessore di 300 μm dalla pelle plantare e dorsale del ratto posteriore, i due tipici siti cutanei pelosi e glabri. Qui, il peptide correlato al gene della calcitonina etichetta le fibre nervose sensoriali, mentre la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 etichettano rispettivamente i vasi sanguigni e linfatici. Sotto un microscopio confocale, le fibre nervose sensoriali etichettate sono state seguite completamente a una distanza più lunga, correndo in fasci nello strato cutaneo profondo e freestyle nello strato superficiale. Queste fibre nervose correvano in parallelo o circondavano i vasi sanguigni e i vasi linfatici formavano una rete tridimensionale (3D) nella pelle pelosa e glabra. L'attuale protocollo fornisce un approccio più efficace allo studio dell'innervazione cutanea rispetto ai metodi convenzionali esistenti dal punto di vista metodologico.

Dopo una tripla colorazione fluorescente, le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici sono stati chiaramente etichettati con CGRP, falloidina e LYVE1, rispettivamente, nella pelle pelosa e glabra (Figura 3,4). Con il trattamento di compensazione, le fibre nervose CGRP-positive, i vasi sanguigni phalloidin-positivi e i vasi linfatici LYVE1-positivi possono essere ripresi a una profondità maggiore per acquisire le informazioni strutturali complete della pelle (<stro...

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Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.

Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Il nostro protocollo ha fornito un metodo fattibile per osservare la sezione di sincronizzazione utilizzando il microscopio confocale, che potrebbe garantire precisione nell'osservazione delle fibre nervose. Il protocollo di pulizia dei tessuti semplice e facile è uno dei principali vantaggi di questa tecnica. Il processo di pulizia dei tessuti è efficiente e richiede da circa 30 minuti a un'ora.Condurre la perfusione sul ratto eutanasizzato come menzionato nel manoscritto del testo. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore. Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post fissare i tessuti in 4% da aldeide in 0,1 PB molare per due ore.Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti della pelle in 2% di agarosio a 37 gradi Celsius e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento. Fissare il tessuto montato sul microtono vibrante con acqua ghiacciata e affettarli ad uno spessore di 500 micrometri in direzione trasversale. Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS.Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di 2% tritone X-100 in 1x PBS durante la notte a quattro gradi Celsius. Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni tissutali nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE-1 di pecora nel tampone di diluizione nel tubo della micro centrifuga.Quindi ruotare sullo shaker per due giorni a quattro gradi Celsius. Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius nel tampone di lavaggio. Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari in un tubo di micro centrifuga e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker per cinque ore a quattro gradi Celsius.Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio due volte per un'ora a temperatura ambiente. Mantenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti e ruotare delicatamente a 60 rotazioni al minuto sullo shaker per un'ora a temperatura ambiente.Montare i tessuti trasparenti sul vetrino, quindi circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia del tessuto fresco e coprire lo scivolamento. Il modello 3D ha dimostrato che le fibre nervose positive CGRP passavano attraverso il tessuto sottocutaneo e il derma fino all'epidermide. Queste fibre nervose correvano in fasci nel tessuto sottocutaneo ramificato all'interno del derma e terminato nell'epidermide.Al contrario, la falloidina nei vasi sanguigni positivi e i vasi linfatici positivi LYVE-1 sono distribuiti nel tessuto sottocutaneo e nel derma. Generalmente le fibre nervose positive CGRP correvano parallele o circondate dai vasi sanguigni e dai vasi linfatici formando una rete 3D nella pelle pelosa e glabra. Con l'approccio convenzionale, sebbene i vasi sanguigni delle fibre nervose e i vasi linfatici fossero chiaramente etichettati con CGRP falloidina e LYVE-1 nelle sezioni sottili, l'osservazione di queste strutture era limitata dallo spessore della fetta e non può essere osservata completamente.Nella sezione con uno spessore di 30 micrometri, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose positive CGRP. Nelle sezioni di tessuto spesse 300 micrometri, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose positive CGRP della pelle glabra è stata significativamente aumentata. È importante utilizzare il tampone di pulizia con un'elevata pressione osmotica dopo l'incubazione degli anticorpi.Più volte, è necessario il tempo di pulizia richiesto per la colorazione immunofluorescenza. Seguendo questa procedura, riteniamo che esista anche la possibilità di colorazione e osservazione di altri tessuti e organi in sei sezioni. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori di neuroscienze a incontrare la superficie e lo stato delle fibre neurologiche.Ci aiuta anche a osservare l'innovazione di tessuti e organi.

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In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

Un ratto di modello di affaticamento centrale utilizzando una versione modificata più piattaforma metodo

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...