Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

이 연구는 중국 의학 과학 혁신 기금의 중국 아카데미에 의해 지원되었다 (프로젝트 코드 번호. CI2021A03404) 및 국가 전통 중국 의학 학제 간 혁신 기금 (프로젝트 코드 번호. ZYYCXTD-D-202202).

본 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호 D2018-04-13-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트 (Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 본 연구에 사용하였다. 모든 동물은 온도와 습도가 조절 된 12 시간의 빛 / 어둠주기에 수용?...

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	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

본 연구는 클리어링 처리와 함께 두꺼운 조직 절편에 대한 면역 형광을 사용하여 털이 많고 글래브러스 피부에서 피부 신경 섬유의 상세한 시연을 제공하고 피부 신경을 더 잘 이해하기 위한 3D 뷰를 제공합니다. 최대 1-2일의 항체 인큐베이션 시간 및 하룻밤 세척 과정이 중요하다. 이 두 가지 주요 단계는 두꺼운 절편의 면역 형광 염색 효과에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체의 선택으로부터 또 ?...

신체에서 가장 큰 기관인 피부는 환경에 대한 핵심 인터페이스 역할을하며 많은 신경 섬유 1,2,3에 의해 조밀하게 신경을 씁니다. 피부 신경과민은 이전에 전체 탑재 피부 및 조직 절편 4,5,6에 대한 염색과 같은 다양한 조직학적 방법으로 널리 연구되었지만, 피부 신경 섬유의 상세한 효과적인 입증은 여전히 과제입니다 7,8. 이를 감안할 때, 본 프로토콜은 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 보다 명확하게 나타낼 수 있는 독특한 기술을 개발하였다.
절편의 두께에 의한 한계 때문에, 신경과민된 피부 신경 섬유의 관찰은 획득된 이미지 정보로부터 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 신경 섬유와 국소 조직 및 기관 사이의 관계를 정확하게 묘사하기에 충분히 정확하지 않다. 3D 조직 제거 기술의 출현은 이러한 문제(9,10)를 해결할 수 있는 실현 가능한 방법을 제공한다. 조직 제거 접근법의 빠른 개발은 최근11 시간 동안 조직 구조, 전체 장기, 신경 세포 돌기 및 전체 동물을 연구하기위한 많은 도구를 제공했습니다. 투명한 피부 조직은 공초점 현미경으로 훨씬 더 두꺼운 단면에서 이미징되어 피부 신경 섬유를 시각화하는 데이터를 얻을 수 있습니다.
본 연구에서, 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부는 털이 많고 윤곽이 있는 피부 3,4,7의 두 가지 표적 부위로서 선택되었다. 피부 신경 섬유를 더 먼 거리에서 추적하기 위해, 피부 조직을 면역조직화학 및 조직화학적 염색을 위해 300 μm의 두께로 슬라이스하고, 이어서 조직 소거 처리를 하였다. CGRP는 감각 신경 섬유12,13을 라벨링하는데 사용되었다. 또한, 조직 배경에 피부 신경 섬유를 강조하기 위해, 팔로이드인 및 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE1)을 혈관과 림프관을 각각14,15로 표지하기 위해 추가로 사용하였다.
이러한 접근법은 피부 신경 섬유의 고해상도 뷰를 입증하고 또한 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관 간의 공간적 상관 관계를 시각화하기 위해 적용 할 수있는 간단한 방법을 제공했으며, 이는 병리학 적 조건 하에서 정상 피부의 항상성 및 피부 변화를 이해하는 데 훨씬 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

피부 신경은 말초 신경계의 중요한 부분입니다. 피부 신경 섬유에 대한 연구가 빠르게 진행되었지만, 분포 및 화학적 특성에 대한 대부분의 이해는 얇은 조직 절편에 대한 기존의 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색에서 비롯됩니다. 조직 제거 기술의 발달로, 더 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 볼 수있게되었습니다. 본 프로토콜은 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부로부터 300 μm의 두께로 조직 절편에 대한 다중 형광 염색을 기술하며, 두 개의 전형적인 털이 많고 윤곽이 있는 피부 부위이다. 여기서, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 감각신경섬유를 표지하는 반면, 팔로이드인과 림프관내피히알루로난 수용체 1은 혈액과 림프관을 각각 표지한다. 공초점 현미경 하에서, 라벨이 붙은 감각 신경 섬유는 더 먼 거리에서 완전히 추적되었고, 깊은 피부 층의 번들과 피상층의 자유형으로 달렸다. 이 신경 섬유는 혈관과 평행하거나 혈관을 둘러싸고 있었고, 림프관은 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3차원(3D) 네트워크를 형성했다. 현재의 프로토콜은 방법론 관점에서 기존의 기존의 방법보다 피부 신경을 연구하는 데보다 효과적인 접근법을 제공합니다.

삼중 형광 염색 후, 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 털이 많은 피부와 글래브러스 피부에서 각각 CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 명확하게 표지하였다(도 3,4). 클리어링 처리를 통해 CGRP 양성 신경 섬유, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관을 더 깊이 이미지화하여 피부의 완전한 구조 정보를 얻을 수 있습니다 (그림 3). 이러한 조직 구조가 3D 패턴?...

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Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.

여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

우리의 프로토콜은 공초점 현미경을 사용하여 동기화 섹션을 관찰 할 수있는 실현 가능한 방법을 제공하여 신경 섬유의 관찰에서 정밀도를 보장 할 수있었습니다. 간단하고 쉬운 조직 청소 프로토콜은이 기술의 주요 장점입니다. 조직 청소 과정은 효율적이며 약 30 분에서 한 시간이 걸립니다.텍스트 원고에 언급 된 바와 같이 안락사 된 쥐에 관류를 실시하십시오. 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오. 냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 0.1몰 PB의 알데히드로부터 4%로 고정시킨 후 두 시간 동안 고정시킨다.세척 후 피부 조직을 섭씨 37도에서 2 % 아가로스에 넣고 냉각을 위해 아이스 박스 안에 넣으십시오. 장착 된 조직을 얼음물로 진동 마이크로 톤에 고정하고 횡단 방향으로 500 마이크로 미터의 두께로 슬라이스하십시오. 슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고 1x PBS로 여섯 웰 플레이트에 보관한다.조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 1x PBS 중의 2%트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 조직 절편을 블로킹 버퍼에 넣고 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 쉐이커 위에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다. 조직 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP 및 양 폴리클로날 항-LYVE-1 항체의 1차 항체를 포함하는 용액을 마이크로 원심분리 튜브의 희석 완충액 내로 옮긴다.그런 다음 쉐이커에서 섭씨 네 도에서 이틀 동안 회전하십시오. 실온에서 세척 완충액으로 조직 절편을 두 번 세척한 다음, 세척 완충액에서 섭씨 네 도에서 밤새 진탕기에 보관하십시오. 다음날, 조직 절편을 이차 항체를 함유하는 혼합 용액으로 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 섭씨 네 도에서 5시간 동안 진탕기 상에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다.여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 한 시간 동안 세척 완충액으로 두 번 세척하십시오. 조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 쉐이커의 세척 완충액에 보관하십시오. 조직 절편을 조직 제거 시약 내로 옮기고 실온에서 한 시간 동안 쉐이커 상에서 분당 60회 회전으로 부드럽게 회전시킨다.슬라이드에 맑은 조직을 장착한 다음 스페이서로 조직을 동그라미로 만들고 신선한 조직 제거 시약과 커버 슬립으로 틈새를 붙입니다. 3D 패턴은 CGRP 양성 신경 섬유가 피하 조직 및 진피를 통해 표피까지 통과한다는 것을 입증했습니다. 이들 신경 섬유는 진피 내에서 분지된 피하 조직에서 다발로 달렸고 표피에서 종결되었다.대조적으로, 양성 혈관 및 LYVE-1 양성 림프관의 phalloidin은 피하 조직 및 진피에 분포한다. 일반적으로 CGRP 양성 신경 섬유는 혈관과 림프관과 평행하거나 둘러쌌으며 털이 많고 윤기가 나는 피부에서 3D 네트워크를 형성한다. 종래의 접근법으로, 신경 섬유 혈관과 림프관이 얇은 단면에서 CGRP phalloidin 및 LYVE-1로 명확하게 표지되었지만, 이러한 구조의 관찰은 슬라이스 두께에 의해 제한되었고 완전히 관찰 될 수 없었다.두께가 30 마이크로미터인 구간에서, CGRP 양성 신경 섬유의 표면적에서 털이 많은 피부와 글라브루스 피부 사이에는 차이가 없었다. 300 마이크로미터 두께의 조직 절편에서, 털이 많은 피부와 비교하여, 글래브러스 피부의 CGRP 양성 신경 섬유의 표면적이 상당히 증가하였다. 항체 인큐베이션 후 높은 삼투압으로 세척 완충액을 사용하는 것이 중요합니다.여러 번, 면역 형광 염색에 필요한 세척 시간이 필요하다. 이 절차에 따라, 우리는 여섯 섹션에서 다른 조직과 장기의 염색 및 관찰의 가능성이 또한 존재한다고 생각합니다. 이 기술은 신경 과학 연구자들이 표면적과 신경 섬유의 상태를 만나는 데 도움이 될 수 있습니다.또한 조직과 기관의 혁신을 관찰하는 데 도움이됩니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

크로스 모달 변수 패턴 분석

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

연구

신경과학

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

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In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

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The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

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In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

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Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

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Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...