Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Denne studien ble støttet av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Prosjektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (Prosjektkodenr. ZYYCXTD-D-202202).

Den nåværende studien ble godkjent av Etikkkomiteen ved Institutt for akupunktur og moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referansenummer D2018-04-13-1). Alle prosedyrer ble utført etter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tre voksne hannrotter (Sprague-Dawley, vekt 230 ± 15 g) ble brukt i denne studien. Alle dyrene ble plassert i en 12 timers lys/ mørk syklus med kontrollert temperatur og fuktighet og tillot f...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Den nåværende studien gir en detaljert demonstrasjon av de kutane nervefibrene i den hårete og glabrøse huden ved å bruke immunfluorescens på tykkere vevsseksjoner med ryddingsbehandling og en 3D-visning for å forstå hudens innervasjon bedre. Antistoffinkubasjonstiden på opptil 1-2 dager og en rengjøringsprosess over natten er viktig. Disse to viktige trinnene påvirker direkte immunfluorescensfargingseffekten av tykke seksjoner. Et annet problem ble reist fra valg av antistoffer, ikke alle er egnet for tykke s...

Huden, det største organet i kroppen, som tjener som et nøkkelgrensesnitt for miljøet, er tett innervated av mange nervefibre 1,2,3. Selv om hudinnvandring har blitt studert mye tidligere med ulike histologiske metoder, for eksempel farging på helmonterte hud- og vevsseksjoner 4,5,6, er den detaljerte effektive demonstrasjonen av kutane nervefibre fortsatt en utfordring 7,8. Gitt dette utviklet den nåværende protokollen en unik teknikk for å vise kutane nervefibre tydeligere i den tykke vevsdelen.
På grunn av grensen ved tykkelsen på seksjoner er observasjonen av innerverte hudnervefibre ikke presis nok til å nøyaktig skildre forholdet mellom calcitonin genrelatert peptid (CGRP) nervefibre og lokale vev og organer fra den oppkjøpte bildeinformasjonen. Fremveksten av 3D-vevsryddingsteknologi gir en mulig metode for å løse dette problemet 9,10. Den raske utviklingen av vevsryddingsmetoder har tilbudt mange verktøy for å studere vevsstrukturer, hele organer, nevronprojeksjoner og hele dyr i nyere tid11. Det gjennomsiktige hudvevet kan avbildes i en mye tykkere del ved konfokal mikroskopi for å få dataene til å visualisere kutane nervefibre.
I den nåværende studien ble plantar og dorsal hud av en rotte bakfot valgt som de to målstedene for hårete og glabrøse hud 3,4,7. For å spore de kutane nervefibrene på lengre avstand, ble hudvevet skiver i tykkelsen på 300 μm for immunhiistokjemisk og histokjemisk farging, etterfulgt av vevsryddingsbehandling. CGRP ble brukt til å merke de sensoriske nervefibrene12,13. I tillegg, for å markere de kutane nervefibrene på vevsbakgrunnen, ble falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 (LYVE1) videre brukt til å merke blodkarene og lymfekarene, henholdsvis14,15.
Disse tilnærmingene ga en enkel metode som kan brukes for å demonstrere en høyoppløselig visning av kutane nervefibre og også å visualisere den romlige korrelasjonen mellom nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i huden, noe som kan gi mye mer informasjon for å forstå homeostase av normal hud og den kutane endringen under de patologiske forholdene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Hud innervering er en viktig del av det perifere nervesystemet. Selv om studien av kutane nervefibre har utviklet seg raskt, kommer det meste av forståelsen av deres fordelingsmessige og kjemiske egenskaper fra konvensjonell histokjemisk og immunhiistokjemisk farging på tynne vevsseksjoner. Med utviklingen av vevsryddingsteknikken har det blitt mulig å se de kutane nervefibrene på tykkere vevsseksjoner. Den nåværende protokollen beskriver flere fluorescerende flekker på vevsseksjoner med en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud av rotte bakfot, de to typiske hårete og glabrøse hudstedene. Her merker calcitoningenrelatert peptid de sensoriske nervefibrene, mens falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 merker henholdsvis blod- og lymfekarene. Under et konfokalt mikroskop ble de merkede sensoriske nervefibrene fulgt helt på lengre avstand, og løp i bunter i det dype kutane laget og freestyle i det overfladiske laget. Disse nervefibrene løp parallelt med eller omringet blodkarene, og lymfekar dannet et tredimensjonalt (3D) nettverk i hårete og glabroushuden. Den nåværende protokollen gir en mer effektiv tilnærming til å studere hud innervering enn de eksisterende konvensjonelle metodene fra metodikkperspektivet.

Etter trippel fluorescerende farging ble nervefibrene, blodkarene og lymfekarene tydelig merket med henholdsvis CGRP, falloidin og LYVE1 i den hårete og glabrøse huden (figur 3,4). Med ryddingsbehandlingen kan de CGRP-positive nervefibrene, falloidinpositive blodårene og LYVE1-positive lymfekarene avbildes i større dybde for å skaffe seg fullstendig strukturell informasjon om huden (figur 3). Da disse vevsstrukturene ble ytterligere rekonst...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Tykkelsen på vevsseksjoner begrenset den morfologiske studien av hudens innervering. Den nåværende protokollen beskriver en unik vevsryddingsteknikk for å visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vevsseksjoner under konfokal mikroskopi.

Demonstrere hårete og glabrøse hudinnvandring i et 3D-mønster ved hjelp av flere fluorescerende fargings- og vevsryddingsmetoder

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Vår protokoll ga en mulig metode for å observere synkroniseringsdelen ved hjelp av konfokalt mikroskop, noe som kunne sikre presisjon i observasjonen av nervefibrene. Enkel og enkel vevsrengjøringsprotokoll er en stor fordel med denne teknikken. Vevrengjøringsprosessen er effektiv, og det tar omtrent 30 minutter til en time.Utfør perfusjon på den euthanized rotten som nevnt i tekstmanuskriptet. Bruk en skalpell for å fjerne huden på dorsum og såle fra bakpoten. For prøver som krever en frossen seksjon, legg vevet i 4% fra aldehyd i 0,1 molar PB i to timer.Etter vask, legg inn hudvevet i 2% agarose ved 37 grader Celsius og legg dem inne i isboksen for kjøling. Fest det monterte vevet på den vibratoriske mikrotonen med isvann og skjær dem i en tykkelse på 500 mikrometer i tverrretningen. Etter kutting, fjern agarose fra seksjonene og lagre dem i en seks brønnplate med 1x PBS.Inkuber vevsseksjonene i en løsning på 2% triton X-100 i 1x PBS over natten ved fire grader Celsius. Plasser vevsdelene i blokkeringsbufferen og roter ved 72 rotasjoner per minutt på shakeren over natten ved fire grader Celsius. Overfør vevsseksjonene til løsningen som inneholder de primære antistoffene til musmonoklonal anti-CGRP og sau polyklonalt anti-LYVE-1 antistoff i fortynningsbuffer i mikrosentrifugerøret.Roter deretter på shakeren i to dager ved fire grader Celsius. Vask vevsseksjonene to ganger med vaskebuffer ved romtemperatur, og hold dem deretter på shakeren over natten ved fire grader Celsius i vaskebufferen. Neste dag overfører du vevsdelene til den blandede løsningen som inneholder sekundære antistoffer i et mikrosentrifugerør og roterer ved 72 rotasjoner per minutt på shakeren i fem timer ved fire grader Celsius.Vask vevsdelene i en seks brønnplate med vaskebuffer to ganger i en time ved romtemperatur. Hold vevsdelene i vaskebuffer på shakeren over natten ved fire grader Celsius. Overfør vevsseksjonene inn i vevsryddingsreagenset og roter ved 60 rotasjoner per minutt på shakeren forsiktig i en time ved romtemperatur.Monter det klare vevet på lysbildet og sirkle deretter vevet med en avstandsstykke og hold gapet med friskt vevsryddingsreagens og dekkslipp. 3D-mønsteret viste at CGRP positive nervefibre passerte gjennom det subkutane vevet og dermis til epidermis. Disse nervefibrene kjørte i bunter i det subkutane vevet forgrenet innenfor dermis og avsluttet i epidermis.Derimot fordeles falloidin i positive blodårer og LYVE-1 positive lymfatiske kar i det subkutane vevet og dermis. Generelt løp CGRP positive nervefibre parallelt med eller omringet blodkarene og lymfatiske karene som danner et 3D-nettverk i den hårete og glabrøse huden. Med den konvensjonelle tilnærmingen, selv om nervefibrene blodkar og lymfatiske kar var tydelig merket med CGRP falloidin og LYVE-1 i de tynne delene, var observasjonen av disse strukturene begrenset av skivetykkelsen og kan ikke observeres helt.I delen med en tykkelse på 30 mikrometer var det ingen forskjell mellom hårete hud og glabrous hud i overflatearealet av CGRP positive nervefibre. I de 300 mikrometer tykke vevsdelene, sammenlignet med hårete hud, ble overflatearealet av CGRP positive nervefibre av glabrøs hud betydelig økt. Det er viktig å bruke rengjøringsbufferen med høyt osmotisk trykk etter antistoffinkubasjon.Flere ganger er rengjøringstiden som kreves for immunfluorescensfarging nødvendig. Etter denne prosedyren tror vi det er mulighet for farging og observasjon av andre vev og organer i seks seksjoner også eksisterer. Denne teknikken kan hjelpe nevrovitenskapsforskere som møter overflatearealet og tilstanden til nevrofibre.Det hjelper oss også å observere innovasjonen av vev og organer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D modellering av sideventriklene og Histologisk Karakterisering av periventricular Tissue hos mennesker og mus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse av Utvikling Tooth Germ Innervasjon Bruke mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifisering av endosom og lysosommotiliteter i dyrkede neuroner ved bruk av fluorescerende prober

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv fjerne metoder for rask produksjon av optisk åpenhet i hele CNS vev

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

En rotte modell av sentral Fatigue bruker en modifisert flere plattform-metoden

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofob vevsryddingsmetode for rottehjernevev

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...