Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) e o Fundo Nacional de Inovação Interdisciplinar da Medicina Tradicional Chinesa (Project Code no. ZYYCXTD-D-202202).

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-04-13-1). Todos os procedimentos foram realizados seguindo o Guia Nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Neste estudo foram utilizados três ratos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12h com temperatura e umidade controladas ...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

O presente estudo fornece uma demonstração detalhada das fibras nervosas cutâneas na pele pelrosa e glabrous usando imunofluorescência em seções de tecido mais grosso com tratamento de limpeza e uma visão 3D para entender melhor a inervação da pele. O tempo de incubação de anticorpos de até 1-2 dias e um processo de limpeza noturno são importantes. Estas duas etapas-chave afetam diretamente o efeito de coloração da imunofluorescência de seções grossas. Outro problema foi levantado a partir da escolha de...

A pele, o maior órgão do corpo, servindo como uma interface chave para o ambiente, é densamente inervada por muitas fibras nervosas 1,2,3. Embora a inervação da pele tenha sido amplamente estudada anteriormente com vários métodos histológicos, como a coloração em seções de pele e tecido demontagem total 4,5,6, a demonstração detalhada e eficaz de fibras nervosas cutâneas ainda é um desafio 7,8. Diante disso, o presente protocolo desenvolveu uma técnica única para exibir fibras nervosas cutâneas mais claramente na seção de tecido grosso.
Devido ao limite pela espessura das seções, a observação de fibras nervosas da pele inervadas não é precisa o suficiente para descrever com precisão a relação entre as fibras nervosas relacionadas ao gene da calcitonina (CGRP) e tecidos e órgãos locais a partir das informações de imagem adquiridas. O surgimento da tecnologia de limpeza de tecidos 3D fornece um método viável para resolver esse problema 9,10. O rápido desenvolvimento de abordagens de limpeza de tecidos tem oferecido muitas ferramentas para estudar estruturas teciduais, órgãos inteiros, projeções neuronais e animais inteiros nos últimostempos 11. O tecido da pele transparente pode ser imageado em uma seção muito mais espessa por microscopia confocal para obter os dados para visualizar fibras nervosas cutâneas.
No presente estudo, a pele plantar e dorsal de um pé traseiro de rato foi selecionada como os dois locais alvo de pelepelrosa e glabrous 3,4,7. Para traçar as fibras nervosas cutâneas a uma distância maior, o tecido da pele foi cortado na espessura de 300 μm para coloração imunohistoquímica e histoquímica, seguido de tratamento de limpeza tecidual. O CGRP foi usado para rotular as fibras sensoriais do nervo12,13. Além disso, para destacar as fibras nervosas cutâneas no fundo tecidual, a faloidina e o receptor de hialuronan do vaso linfático 1 (LYVE1) foram ainda utilizados para rotular os vasos sanguíneos e os vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Essas abordagens forneceram um método simples que pode ser aplicado para demonstrar uma visão de alta resolução das fibras nervosas cutâneas e também para visualizar a correlação espacial entre as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele, o que pode fornecer muito mais informações para entender a homeostase da pele normal e a alteração cutânea sob as condições patológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

A inervação da pele é uma parte importante do sistema nervoso periférico. Embora o estudo das fibras nervosas cutâneas tenha progredido rapidamente, a maior parte da compreensão de suas características distribucionais e químicas vem da coloração histoquímica e imunohistoquímica convencional em seções de tecidos finos. Com o desenvolvimento da técnica de limpeza tecidual, tornou-se possível ver as fibras nervosas cutâneas em seções de tecido mais grossas. O presente protocolo descreve múltiplas manchas fluorescentes em seções de tecido a uma espessura de 300 μm da pele plantar e dorsal do pé traseiro de rato, os dois típicos locais de pele peludo e glabrous. Aqui, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina rotula as fibras nervosas sensoriais, enquanto a falo e o receptor endotelial do vaso endotelial 1 rotulam o sangue e os vasos linfáticos, respectivamente. Sob um microscópio confocal, as fibras nervosas sensoriais rotuladas foram seguidas completamente a uma distância mais longa, correndo em feixes na camada cutânea profunda e estilo livre na camada superficial. Essas fibras nervosas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos, e os vasos linfáticos formavam uma rede tridimensional (3D) na pele pelirpelenta e glabrous. O protocolo atual fornece uma abordagem mais eficaz para estudar a inervação da pele do que os métodos convencionais existentes do ponto de vista da metodologia.

Após a coloração fluorescente tripla, as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos foram claramente rotulados com CGRP, phalloidin e LYVE1, respectivamente, na pele pelrosa e glabrou (Figura 3,4). Com o tratamento de compensação, as fibras nervosas CGRP positivas, os vasos sanguíneos fábula positivo e os vasos linfáticos LYVE1 positivos podem ser imagens em maior profundidade para adquirir as informações estruturais completas da pele (<strong class="xf...

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Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.

Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Nosso protocolo forneceu um método viável para observar a seção de sincronização usando microscópio confocal, o que poderia garantir precisão na observação das fibras nervosas. Protocolo simples e fácil de limpeza de tecidos é uma das principais vantagens dessa técnica. O processo de limpeza de tecidos é eficiente e leva cerca de 30 minutos a uma hora.Conduta perfusão no rato eutanizado como mencionado no manuscrito do texto. Use um bisturi para remover a pele do dorso e sola da pata traseira. Para amostras que requerem uma seção congelada, corrija os tecidos em 4% de aldeído em PB molar de 0,1 por duas horas.Após a lavagem, incorpore os tecidos da pele em 2% agarose a 37 graus Celsius e coloque-os dentro da caixa de gelo para resfriamento. Fixar o tecido montado na microtona vibratória com água gelada e cortá-los a uma espessura de 500 micrômetros na direção transversal. Após o corte, retire a agarose das seções e armazene-as em uma placa de seis poços com 1x PBS.Incubar as seções teciduais em uma solução de 2%triton X-100 em 1x PBS durante a noite a quatro graus Celsius. Coloque as seções teciduais no tampão de bloqueio e gire a 72 rotações por minuto no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato e do anticorpo anti-LYVE-1 de ovelha em tampão de diluição no tubo de micro centrífuga.Em seguida, gire no shaker por dois dias a quatro graus Celsius. Lave as seções teciduais duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente, em seguida, mantenha-as no shaker durante a noite a quatro graus Celsius no tampão de lavagem. No dia seguinte, transfira as seções teciduais para a solução mista contendo os anticorpos secundários em um tubo de micro centrífugas e gire a 72 rotações por minuto no agitador por cinco horas a quatro graus Celsius.Lave as seções de tecido em uma placa de seis poços com tampão de lavagem duas vezes por uma hora em temperatura ambiente. Mantenha as seções teciduais na lavagem do tampão no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para o reagente de limpeza tecidual e gire a 60 rotações por minuto no agitador suavemente por uma hora à temperatura ambiente.Monte os tecidos claros na lâmina, em seguida, circule os tecidos com um espaçador e coloque a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e deslize de cobertura. O padrão 3D demonstrou que as fibras nervosas positivas CGRP passaram pelo tecido subcutâneo e derme para a epiderme. Estas fibras nervosas correram em feixes no tecido subcutâneo ramificado dentro da derme e terminadas na epiderme.Em contraste, a faloidina nos vasos sanguíneos positivos e os vasos linfáticos positivos LYVE-1 estão distribuídos no tecido subcutâneo e na dermis. Geralmente, as fibras nervosas positivas CGRP corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos e vasos linfáticos formando uma rede 3D na pele pelrosa e glabrous. Com a abordagem convencional, embora os vasos sanguíneos das fibras nervosas e vasos linfáticos tenham sido claramente rotulados com fábula CGRP e LYVE-1 nas seções finas, a observação dessas estruturas foi limitada pela espessura da fatia e não pode ser observada completamente.Na seção com espessura de 30 micrômetros, não houve diferença entre pele pelrosa e pele glabrous na superfície das fibras nervosas positivas CGRP. Nas seções de tecido de 300 micrômetros de espessura, em comparação com a pele pelrosa, a área superficial das fibras nervosas positivas CGRP da pele glabrous foi significativamente aumentada. É importante usar o tampão de limpeza com alta pressão osmótica após a incubação de anticorpos.Várias vezes, o tempo de limpeza necessário para a coloração da imunoexorescência é necessário. Após esse procedimento, acreditamos que existe também a possibilidade de coloração e observação de outros tecidos e órgãos em seis seções. Essa técnica poderia auxiliar pesquisadores de neurociência encontrando a área da superfície e o estado das fibras neurológicas.Também nos ajuda a observar a inovação de tecidos e órgãos.

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A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

Um rato do modelo de fadiga Central usando um modificado método de plataforma múltipla

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...