Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Denna studie stöddes av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkod nr. CI2021A03404) och National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (projektkod nr. ZYYCXTD-D-202202).

Den aktuella studien godkändes av etikkommittén vid Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referensnummer D2018-04-13-1). Alla procedurer genomfördes enligt National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre vuxna hanråttor (Sprague-Dawley, vikt 230 ± 15 g) användes i denna studie. Alla djur inhystes i en 12 h ljus/mörk cykel med kontrollerad temperatur och luftfuktighet och fick fri til...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Den aktuella studien ger en detaljerad demonstration av de kutana nervfibrerna i den håriga och glättiga huden genom att använda immunofluorescens på tjockare vävnadssektioner med rensande behandling och en 3D-vy för att förstå hudens innervation bättre. Antikroppsinkubationstiden på upp till 1-2 dagar och en rengöringsprocess över natten är viktiga. Dessa två viktiga steg påverkar direkt immunofluorescensfärgningseffekten av tjocka sektioner. Ett ytterligare problem togs upp från valet av antikroppar, s...

Huden, det största organet i kroppen, som fungerar som ett viktigt gränssnitt till miljön, är tätt innerverat av många nervfibrer 1,2,3. Även om hudinnervation har studerats i stor utsträckning tidigare med olika histologiska metoder, såsom färgning på helmonterad hud ochvävnadssektioner 4,5,6, är den detaljerade effektiva demonstrationen av kutana nervfibrer fortfarande en utmaning 7,8. Med tanke på detta utvecklade det nuvarande protokollet en unik teknik för att uppvisa kutana nervfibrer tydligare i den tjocka vävnadssektionen.
På grund av gränsen för sektionernas tjocklek är observationen av innerverade hudnervfibrer inte tillräckligt exakt för att exakt skildra förhållandet mellan kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) nervfibrer och lokala vävnader och organ från den förvärvade bildinformationen. Framväxten av 3D-vävnadsrensningsteknik ger en genomförbar metod för att lösa detta problem 9,10. Den snabba utvecklingen av vävnadsrensningsmetoder har erbjudit många verktyg för att studera vävnadsstrukturer, hela organ, neuronala projektioner och hela djur på senare tid11. Den transparenta hudvävnaden kan avbildas i en mycket tjockare sektion med konfokalmikroskopi för att erhålla data för att visualisera kutana nervfibrer.
I den aktuella studien valdes plantar- och rygghuden hos en råtta bakfot som de två målplatserna för hårig och glättig hud 3,4,7. För att spåra de kutana nervfibrerna på ett längre avstånd skivades hudvävnaden med tjockleken 300 μm för immunohistokemisk och histokemisk färgning, följt av vävnadsrensningsbehandling. CGRP användes för att märka de sensoriska nervfibrerna 12,13. Dessutom, för att markera de kutana nervfibrerna på vävnadsbakgrunden, användes falloidin och lymfkärlendotelial hyaluronanreceptor 1 (LYVE1) ytterligare för att märka blodkärlen respektive lymfkärlen14,15.
Dessa tillvägagångssätt gav en enkel metod som kan tillämpas för att visa en högupplöst bild av de kutana nervfibrerna och även för att visualisera den rumsliga korrelationen mellan nervfibrerna, blodkärlen och lymfkärlen i huden, vilket kan ge mycket mer information för att förstå homeostasen hos den normala huden och den kutana förändringen under de patologiska förhållandena.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Hudinnervation är en viktig del av det perifera nervsystemet. Även om studien av de kutana nervfibrerna har utvecklats snabbt, kommer det mesta av förståelsen av deras fördelnings- och kemiska egenskaper från konventionell histokemisk och immunohistokemisk färgning på tunna vävnadssektioner. Med utvecklingen av vävnadsrensningstekniken har det blivit möjligt att se de kutana nervfibrerna på tjockare vävnadssektioner. Det nuvarande protokollet beskriver flera fluorescerande färgning på vävnadssektioner med en tjocklek av 300 μm från plantar- och dorsalhuden på råtta bakfot, de två typiska håriga och glättiga hudställena. Här märker den kalcitoningenrelaterade peptiden de sensoriska nervfibrerna, medan falloidin och lymfkärlen endotelial hyaluronanreceptor 1 märker blodet respektive lymfkärlen. Under ett konfokalmikroskop följdes de märkta sensoriska nervfibrerna helt på längre avstånd, som löpte i buntar i det djupa kutana skiktet och freestyle i det ytliga lagret. Dessa nervfibrer löpte parallellt med eller omgav blodkärlen, och lymfkärl bildade ett tredimensionellt (3D) nätverk i den håriga och glättiga huden. Det nuvarande protokollet ger ett mer effektivt tillvägagångssätt för att studera hudens innervation än de befintliga konventionella metoderna ur metodperspektivet.

Efter trippel fluorescerande färgning märktes nervfibrerna, blodkärlen och lymfkärlen tydligt med CGRP, falloidin respektive LYVE1 i den håriga och glättiga huden (figur 3,4). Med clearingbehandlingen kan de CGRP-positiva nervfibrerna, falloidinpositiva blodkärl och LYVE1-positiva lymfkärl avbildas på ett större djup för att få fullständig strukturell information om huden (Figur 3). När dessa vävnadsstrukturer rekonstruerades ytte...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Tjockleken på vävnadssektioner begränsade den morfologiska studien av hudens innervation. Det nuvarande protokollet beskriver en unik vävnadsrensningsteknik för att visualisera kutana nervfibrer i tjocka 300 μm vävnadssektioner under konfokalmikroskopi.

Demonstrera hårig och glättig hudinnervation i ett 3D-mönster med hjälp av flera fluorescerande färgnings- och vävnadsrensningsmetoder

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Vårt protokoll gav en genomförbar metod för att observera synkroniseringssektionen med hjälp av konfokalmikroskop, vilket kunde säkerställa precision vid observation av nervfibrerna. Enkelt och enkelt vävnadsrengöringsprotokoll är en stor fördel med denna teknik. Vävnadsrengöringsprocessen är effektiv och det tar cirka 30 minuter till en timme.Utför perfusion på den avlivade råttan som nämns i textmanuskriptet. Använd en skalpell för att ta bort huden på dorsum och sula från baktassen. För prover som kräver en frusen sektion, efter fixa vävnaderna i 4% från aldehyd i 0,1 molar PB i två timmar.Efter tvättning, bädda in hudvävnaderna i 2% agaros vid 37 grader Celsius och placera dem inuti isboxen för kylning. Fäst den monterade vävnaden på den vibrerande mikrotonen med isvatten och skiva dem med en tjocklek av 500 mikrometer i tvärgående riktning. Efter skivning, ta bort agarosen från sektionerna och förvara dem i en sexbrunnsplatta med 1x PBS.Inkubera vävnadssektionerna i en lösning av 2% triton X-100 i 1x PBS över natten vid fyra grader Celsius. Placera vävnadssektionerna i blockeringsbufferten och rotera med 72 rotationer per minut på skakapparaten över natten vid fyra grader Celsius. Överför vävnadssektionerna till lösningen som innehåller de primära antikropparna av monoklonala anti-CGRP- och fårpolyklonala anti-LYVE-1-antikroppar i utspädningsbuffert i mikrocentrifugröret.Rotera sedan på skakaren i två dagar vid fyra grader Celsius. Tvätta vävnadssektionerna två gånger med tvättbuffert vid rumstemperatur och håll dem sedan på shakern över natten vid fyra grader Celsius i tvättbufferten. Nästa dag överför vävnadssektionerna till den blandade lösningen som innehåller de sekundära antikropparna i ett mikrocentrifugrör och roterar med 72 rotationer per minut på skakapparaten i fem timmar vid fyra grader Celsius.Tvätta vävnadssektionerna i en sexbrunnsplatta med tvättbuffert två gånger i en timme vid rumstemperatur. Håll vävnadssektionerna i tvättbuffert på shakern över natten vid fyra grader Celsius. Överför vävnadssektionerna till vävnadsrensningsreagenset och rotera försiktigt med 60 rotationer per minut i en timme vid rumstemperatur.Montera de klara vävnaderna på bilden och cirkla sedan vävnaderna med en distans och stick gapet med färskt vävnadsrensningsreagens och täckglidning. 3D-mönstret visade att de CGRP-positiva nervfibrerna passerade genom subkutan vävnad och dermis till epidermis. Dessa nervfibrer sprang i buntar i den subkutana vävnaden grenad i dermis och avslutades i epidermis.Däremot fördelas falloidin i positiva blodkärl och LYVE-1-positiva lymfkärl i subkutan vävnad och dermis. I allmänhet löpte de CGRP-positiva nervfibrerna parallellt med eller omgav blodkärlen och lymfkärlen och bildade ett 3D-nätverk i den håriga och glättiga huden. Med det konventionella tillvägagångssättet, även om nervfibrernas blodkärl och lymfkärl tydligt märktes med CGRP-falloidin och LYVE-1 i de tunna sektionerna, begränsades observationen av dessa strukturer av skivtjockleken och kan inte observeras helt.I sektionen med en tjocklek på 30 mikrometer var det ingen skillnad mellan hårig hud och glättig hud i ytan av CGRP-positiva nervfibrer. I de 300 mikrometer tjocka vävnadssektionerna, jämfört med hårig hud, ökade ytan av CGRP-positiva nervfibrer i glättig hud signifikant. Det är viktigt att använda rengöringsbufferten med högt osmotiskt tryck efter antikroppsinkubering.Flera gånger är den rengöringstid som krävs för immunofluorescensfärgningen nödvändig. Efter denna procedur tror vi att det finns en möjlighet att färga och observera andra vävnader och organ i sex sektioner finns också. Denna teknik kan hjälpa neurovetenskapliga forskare som stöter på ytan och tillståndet hos neurofibrer.Det hjälper oss också att observera innovationen av vävnader och organ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Cross-Modal Multivariat Pattern Analysis

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D-modellering av de laterala ventriklama och Histologisk karakterisering av periventrikulär Tissue i människor och mus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analys av Utveckling Tooth Germ Innervation Använda mikroflödes Co-kultur-enheter

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I livmodern elektroporering Approaches att studera retbarhet av neuronala Subpopulationer och encelliga Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv Clearing metoder för snabb produktion av optisk transparens i hela CNS-vävnaden

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

En råtta modell av Central trötthet använder en modifierad metoden med flera plattform

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vävnadsrensningsmetod för råtta hjärnvävnad

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo imaging av fullt aktiv hjärnvävnad i vakna zebrafisk larver och ungdomar genom skalle och hudborttagning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...