Name: demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. CI2021A03404) ve Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Disiplinlerarası İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. ZYYCXTD-D-202202).

Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-04-13-1). Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik ...

<ol>
	<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design.">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181 (2012).</li><li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation.">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).</li><li>Navarro, X., Verd&#250;, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw:+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study.">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).</li><li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin:+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution.">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).</li><li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models:+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity.">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+whole+mount:+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick,+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin.">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster.">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing.">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations.">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing.">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging.">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology.">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li><li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+lymphatic+function.">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).</li><li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates.">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li></ol>

Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikor...

Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir 1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, 4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur 7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.
Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar 9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur11. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.
Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir 3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla 14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.
Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>Fluoview FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG H&#38;L Alexa-Flour488</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep IgG H&#38;L Alexa-Flour405</td>
			<td>Abcam plc.</td>
			<td>ab175676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing stage sliding microtome system</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>v.9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS standard scissor</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td>
			<td>503242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>IS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CGRP antibody</td>
			<td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-57053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered Formalin</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>G2161</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td>
			<td>BT300-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52 solution</td>
			<td>SunJin Lab co.</td>
			<td>RC152001</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular agarose</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td>G-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F13038-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>AF7939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S2002</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>V900116</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>Pattex 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Handles</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S32003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>U2500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S1014-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches

Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.

Üçlü floresan boyama işleminden sonra, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar, tüylü ve göz kamaştırıcı deride sırasıyla CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlendi (Şekil 3,4). Temizleme tedavisi ile, CGRP-pozitif sinir lifleri, faloidin-pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar, cildin tüm yapısal bilgisini elde etmek için daha derin bir derinlikte görüntülenebilir (Şekil 3). Bu doku yapı...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches at JoVE.com

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Protokolümüz, sinir liflerinin gözlemlenmesinde hassasiyet sağlayabilecek konfokal mikroskop kullanarak senkronizasyon bölümünü gözlemlemek için uygulanabilir bir yöntem sağladı. Basit ve kolay doku temizleme protokolü bu tekniğin temel avantajıdır. Doku temizleme işlemi verimlidir ve yaklaşık 30 dakika ila bir saat sürer.Metin el yazmasında belirtildiği gibi ötenazi sıçanı üzerinde perfüzyon yapın. Dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın. Dondurulmuş bir bölüm gerektiren örnekler için, dokuları iki saat boyunca 0.1 molar PB'de aldehitten% 4 oranında sabitleyin.Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 santigrat derecede %2 agaroza gömün ve soğutmak için buz kutusunun içine yerleştirin. Titreşimli mikroton üzerine monte edilen dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 mikrometre kalınlığında dilimleyin. Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS ile altı kuyucuklu bir plakada saklayın.Doku kesitlerini, dört santigrat derecede gece boyunca 1x PBS'de% 2 triton X-100'lük bir çözelti içinde inkübe edin. Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 72 rotasyonda döndürün. Doku kesitlerini, mikro santrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP ve koyun poliklonal anti-LYVE-1 antikorunun birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın.Daha sonra çalkalayıcı üzerinde iki gün boyunca dört santigrat derecede döndürün. Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda dört santigrat derecede gece boyunca çalkalayıcıda tutun. Ertesi gün, doku bölümlerini bir mikro santrifüj tüpünde ikincil antikorları içeren karışık çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 72 rotasyonda dört santigrat derecede beş saat boyunca döndürün.Doku kesitlerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca iki kez yıkama tamponu ile altı kuyucuklu bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ve çalkalayıcı üzerinde dakikada 60 rotasyonda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe döndürün.Şeffaf dokuları slayta monte edin, ardından dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve kapak kayması ile yapıştırın. 3D patern, CGRP pozitif sinir liflerinin deri altı dokusundan ve dermisten epidermise geçtiğini gösterdi. Bu sinir lifleri, dermis içinde dallanmış deri altı dokusunda demetler halinde koştu ve epidermiste sonlandı.Buna karşılık, pozitif kan damarlarındaki faloidin ve LYVE-1 pozitif lenfatik damarlar deri altı dokusunda ve dermiste dağılır. Genellikle CGRP pozitif sinir lifleri, kıllı ve göz kamaştırıcı ciltte 3D bir ağ oluşturan kan damarlarına ve lenfatik damarlara paralel olarak koştu veya onları çevreledi. Konvansiyonel yaklaşımla, sinir lifleri kan damarları ve lenfatik damarlar ince kesitlerde CGRP faloidin ve LYVE-1 ile açıkça etiketlenmiş olmasına rağmen, bu yapıların gözlenmesi dilim kalınlığı ile sınırlıydı ve tam olarak gözlenemiyordu.30 mikrometre kalınlığa sahip kesitte CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanında tüylü deri ile göz kamaştırıcı deri arasında fark yoktu. 300 mikrometre kalınlığındaki doku kesitlerinde, saçlı deri ile karşılaştırıldığında, göz kamaştırıcı cildin CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanı önemli ölçüde artmıştır. Antikor inkübasyonundan sonra temizleme tamponunun yüksek ozmotik basınçla kullanılması önemlidir.Birkaç kez, immüno-floresan boyama için gereken temizleme süresi gereklidir. Bu prosedürü takiben, altı bölümde diğer doku ve organların boyanması ve gözlemlenmesi olasılığının da mevcut olduğuna inanıyoruz. Bu teknik, nörobilim araştırmacılarının yüzey alanı ve nöro liflerin durumuyla karşılaşmalarına yardımcı olabilir.Ayrıca doku ve organların inovasyonunu gözlemlememize yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cross-Modal Multivariate Pattern Analysis

Cross-Modal Çok değişkenli Örüntü Analizi

Multivariate pattern analysis (MVPA) is an increasingly popular method of analyzing functional magnetic resonance imaging (fMRI) data1-4. Typically, the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

Bir fare modeli değiştirilmiş bir kullanarak merkezi yorgunluk birden çok Platform yöntemi

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...