Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillingen R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres tankevækkende diskussioner. Vi takker også oprigtigt Dr (s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres afgørende input. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøveforberedelse og negativ farvning elektronmikroskopi billeddannelse ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Denne protokol indebærer anvendelse af humant eller hvirveldyr hjernevæv. Al forskning blev udført i overensstemmelse med de godkendte institutionelle retningslinjer fra Northwestern University. Den nuværende arbejdsgang er standardiseret ved hjælp af APP-knock in (AppNL-G-F / NL-G-F) musehjerne kortikale og hippocampale hjerneregionekstrakter11. Denne protokol er optimeret til hjerneekstrakter fra mus i 6-9 måneders alderen, og den kan effektivt rense amyloider fra både...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Udvikling af en klar forståelse af amyloid struktur og sammensætning er udfordrende for strukturbiologer og biokemikere på grund af de biologiske kompleksiteter og eksperimentelle begrænsninger ved ekstraktion af rensede fibriller fra AD-hjernevæv16,17. Amyloidfibriller er polymorfe på molekylært niveau og viser en heterogen population af varierende længder og kompleksiteter18,19. For bedre at for...

Amyloid er et ekstremt stabilt supramolekylært arrangement, der findes i et forskelligt panel af proteiner, hvoraf nogle fører til patologiske ændringer1. Akkumuleringen af intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere neurodegenerative sygdomme2. Amyloidaggregater er heterogene og er beriget med et stort antal proteiner og lipider3. I de senere år har interessen for amyloidproteomet skabt betydelig interesse blandt grundlæggende og translationelle neurovidenskabere. Flere metoder er blevet udviklet til at udtrække og rense amyloidaggregater fra mus og post mortem humane hjernevæv. Laserfangst mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering og biokemisk isolering af amyloidaggregater er almindeligt anvendte metoder til at ekstrahere og rense amyloidplakker, fibriller og oligomerer 4,5,6,7. Mange af disse undersøgelser har fokuseret på at bestemme proteinsammensætningen af disse tætpakkede fibrillære aflejringer ved hjælp af semikvantitativ MS. De tilgængelige resultater er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antal co-rensende proteiner, der tidligere er rapporteret, er udfordrende at fortolke.
Den primære begrænsning i den eksisterende litteratur, der beskriver amyloidkerneproteomet i AD- og AD-musemodelhjerner, er, at det oprensede materiale indeholder et uoverskueligt antal samrensende proteiner. Det overordnede mål med denne metode er at overvinde denne begrænsning og udvikle en robust biokemisk oprensning til isolering af amyloidfibrilkerner. Denne strategi anvender en tidligere beskrevet saccharosedensitetsgradient ultracentrifugeringsbaseret biokemisk metode til isolering af SDS uopløselige berigede amyloidfraktioner fra post mortem AD humant og musehjernevæv 8,9. Denne metode bygger på den eksisterende litteratur, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vaske for at fjerne de fleste af de løst bundne amyloidassocierede proteiner, hvilket fører til isolering af højt oprensede amyloidfibriller (figur 1). Fibrillerne renset af denne protokol overvinder flere eksisterende udfordringer, der ofte opstår i strukturelle undersøgelser af amyloidfibriller isoleret fra hjerneekstrakter. Visualisering af disse fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekræfter integriteten og renheden af det rensede materiale (figur 2). I denne undersøgelse opløses de isolerede fibriller og fordøjes til peptider med trypsin, og etiketfri MS-analyse kan let afsløre identiteten af proteinerne, der danner fibrilkernen. Især har nogle af disse proteiner en iboende tendens til at danne supramolekylære samlinger i ikke-membranbundne organeller. Derudover er mange af de proteiner, der er identificeret i analysen af amyloid-beta (Aβ) fibriller, også forbundet med andre neurodegenerative sygdomme, hvilket tyder på, at disse proteiner kan spille en nøglerolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetode vil sandsynligvis ikke ændre eller forstyrre strukturen af fibrilkernerne. Det rensede materiale er også velegnet til en bred vifte af top-down og bottom-up proteomiske analysemetoder og yderligere MS-baserede strukturelle analysestrategier, såsom kemisk tværbinding eller hydrogen-deuteriumudveksling. Den samlede genopretning ved hjælp af denne metode er relativt høj og er således egnet til detaljerede strukturelle undersøgelser, som kræver mikrogram til milligram af det rensede materiale. Det rensede materiale er også velegnet til strukturelle undersøgelser ved hjælp af cryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokol, i kombination med den stabile isotopiske mærkning af pattedyr, kan lette solid-state nukleare magnetiske resonans (NMR) undersøgelser af amyloid struktur10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Proteinholdige fibrillære indeslutninger er vigtige patologiske kendetegn ved flere neurodegenerative sygdomme. I de tidlige stadier af Alzheimers sygdom (AD) danner amyloid-beta-peptider protofibriller i det ekstracellulære rum, som fungerer som frø, der gradvist vokser og modnes til store amyloidplakker. På trods af denne grundlæggende forståelse er den nuværende viden om amyloid fibrilstruktur, sammensætning og aflejringsmønstre i hjernen begrænset. En stor barriere har været manglende evne til at isolere højt oprensede amyloidfibriller fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensning og laserfangst mikrodissektionsbaserede tilgange er tidligere blevet brugt til at isolere amyloider, men er begrænset af den lille mængde materiale, der kan genvindes. Denne nye, robuste protokol beskriver den biokemiske oprensning af amyloid plaquekerner ved hjælp af natriumdodecylsulfat (SDS) opløses med saccharosedensitetsgradient ultracentrifugering og ultralydbehandling og giver meget rene fibriller fra AD-patienter og AD-model hjernevæv. Massespektrometri (MS)-baseret bottom-up proteomisk analyse af det rensede materiale repræsenterer en robust strategi til at identificere næsten alle de primære proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidligere proteomiske undersøgelser af proteiner i amyloid koronae har afsløret en uventet stor og funktionelt forskelligartet samling af proteiner. Især efter raffinering af oprensningsstrategien blev antallet af co-rensende proteiner reduceret med mere end 10 gange, hvilket indikerer den høje renhed af det isolerede SDS uopløselige materiale. Negativ farvning og immuno-guld elektronmikroskopi tillod bekræftelse af renheden af disse præparater. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå de rumlige og biologiske egenskaber, der bidrager til aflejringen af disse proteiner i amyloidindeslutninger. Samlet set er denne analytiske strategi godt positioneret til at øge forståelsen af amyloidbiologi.

Her opsummeres en detaljeret metode til isolering og oprensning af amyloidfibriller ved anvendelse af en modificeret saccharosedensitetsgradient ultracentrifugeringsrensningsmetode (se figur 1). Innovationen i denne metode er inkluderingen af trin i ultralydbehandlingsbaseret vask ved hjælp af et vandbad sonikeringssystem efterfulgt af SDS-opløselighed, som fjerner mange løst associerede proteiner fra amyloidfibrillerne, der renser sammen med de meget tætte og rene fibriller. Ultralydbeh...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Denne biokemiske oprensningsmetode med massespektrometribaseret proteomisk analyse letter den robuste karakterisering af amyloidfibrilkerner, hvilket kan fremskynde identifikationen af mål for forebyggelse af Alzheimers sygdom.

Biokemisk oprensning og proteomisk karakterisering af amyloidfibrilkerner fra hjernen

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Amyloid plaques er nødvendige til diagnosticering af Alzheimers sygdom. De er dog ikke tilstrækkelige. På trods af dette faktum forbliver de gådefulde på grund af udfordringer med at karakterisere deres indhold.Vores protokol er yderst effektiv til at isolere amyloidfibriller ved høj renhed og er velegnet til at forstå de fine detaljer i struktur og sammensætning. At kende proteinindholdet i amyloidplakker kan hjælpe med at identificere målene for terapeutisk intervention, der kan forsinke, forstyrre eller forhindre deres ophobning. Derfor forsinker sygdomsdebut.Denne metode er velegnet til ekstraktion af proteinaflejringer fra degenereret hjernevæv og proteinaggregater i forskellige andre proteinveje. Begynd med at placere en frisk dissekeret eller snap frosset hjernevævsregion i et to milliliter rør indeholdende seks til otte keramiske perler i frisklavet iskold homogeniseringsbuffer. Slib derefter vævet ved hjælp af en perlemøllehomogenisator ved 4.000 o / min med to cyklusser på 30 sekunder til og fra puls.Tilsæt nu ni milliliter iskold homogeniseringsbuffer til den ene milliliter hjernevævshomogenat og et 15 ml rør og forsegl med laboratorievoksfilmstrimler. For at sikre robust opløselighed skal røret rotere natten over ved fire grader Celsius. Den følgende dag tilsættes fast saccharose til vævsekstraktsuspensionen til en slutkoncentration på 1,2 mol.Bland godt og centrifuge havde 250.000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Efter kassering af supernatanten resuspenderes pelleten i to milliliter homogeniseringsbuffer indeholdende 1,9 molær saccharose ved triturering og centrifugering ved 125.000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering overføres det øverste hvide faste lag til et frisk rør og opløses en milliliter iskold vaskebuffer ved at klappe op og ned flere gange.Da pelleten også er beriget med amyloidfibriller, skal du kassere det vandige mellemlag og kombinere pelleten med det øverste lag for et højere udbytte. Centrifuger de kombinerede fraktioner ved 8.000 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Efter kassering af supernatanten skal pelleten resuspenderes i en milliliter iskold fordøjelsesbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i tre timer på en hvirvel.Centrifuger prøven igen, vask derefter pelleten to gange i en milliliter iskold Tris-buffer og centrifuger igen. Efter den anden vask skal pelleten resuspenderes i en milliliter opløselsesbuffer ved at pipettere op og ned og centrifugere røret hurtigt ved 200.000 x g i 60 minutter ved fire grader Celsius. Gem pelleten, reducer derefter saccharosekoncentrationen fra 1,3 til en molar ved at tilsætte 50 millimolar Tris-buffer til supernatanten.Supernatanten centrifugeres igen, og begge pellets og 100 mikroliter Tris-buffer indeholdende 0,5% SDS opløses. Til amyloidrensning opløses de amyloidrige pellets ved hjælp af ultralydbølger i en badsonikeringsanordning i 20 cyklusser, og centrifuger derefter straks materialet ved 20.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Resuspender pelleten i 500 mikroliter 0,5% SDS Tris-buffer og gentag vasken fire gange mere, Efter det sidste centrifugeringstrin vaskes pelleten i 200 mikroliter ultrarent vand og centrifugeres 20.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius for at fjerne resterende vaskemiddel.Opløs den endelige pellet indeholdende rensede amyloidfibriller i 100 mikroliter ultrarent vand. Opløs de rensede 100 mikroliter amyloidfibriller i 400 mikroliter methanol og hvirvelbrønd. Bland derefter 100 mikroliter chloroform og hvirvel igen.Tilsæt derefter 300 mikroliter ultrarent vand og hvirvel grundigt. Efter centrifugering ved 12.000 x g i to minutter ved stuetemperatur fjernes det øverste vandige lag forsigtigt uden at forstyrre grænsefladelaget indeholdende proteinflagen og tilsættes det samme volumen methanol igen. Gentag centrifugeringen, kassér supernatanten og lufttør pelleten.Til fordøjelse opløses pelleten i 50 mikroliter guanidinhydrochloridbuffer og sonikeres i et iskoldt vandbad. Derefter hvirvel grundigt i 45 minutter til en time ved stuetemperatur, tilsæt 50 mikroliter 0,2% overfladeaktiv opløsning og hvirvel igen i yderligere 60 minutter. Tilføj derefter en mikroliter på 500 millimolar TCEP og inkuber i 60 minutter.Tilsæt derefter to mikroliter 500 millimolar iodoacetamid og inkuber i mørke i 20 minutter. Efter inkubationen slukkes iodoacetamiden med fem mikroliter TCEP-opløsning i 15 minutter. Derefter tilsættes det krævede volumen 50 millimolar ammoniumbicarbonatopløsning til røret for at reducere guanidinkoncentrationen til 1,5 mol.Tilsæt også 1% overfladeaktiv opløsning til røret. Tilsæt derefter trypsin og lad røret blande ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag tilsættes myresyre til den fordøjede peptidopløsning for at sænke pH til 2,0, og aktiver derefter C18-spinkolonnen ved at tilsætte 200 mikroliter 50% methanolopløsning og spinde ved 1500 x g i to minutter ved stuetemperatur.Derefter afbalanceres C18-søjleharpiksbedene ved at tilføje 200 mikroliter ækvilibrationsbuffer og spinde igen i to minutter. Efter ækvilibrering anbringes den syrnede peptidopløsning på C18-søjlen og centrifugeres ved 1500 x g i to minutter ved stuetemperatur. Genindlæs flowet, drej kolonnen, og kassér det andet flow igennem.Vask derefter peptiderne bundet til C18-harpiksen to gange med vaskebufferen. Eluter peptidet tre gange ved at tilsætte 40 mikroliter elueringsbuffer og centrifugere søjlen. Tør peptiderne i en hastighedsvakuumkoncentrator ved at fordampe den vandige opløsning.De tørre pellets kan gemmes ved 20 grader Celsius i et par uger før MS-analysen. Congo rød farvning af rensede amyloider dokumenterer berigelsen af amyloidfibrillerne sammenlignet med den SDS-opløselige fraktion. Den SDS-opløselige fraktion viste ikke tilstedeværelsen af amyloider.Strukturen af de rensede fibriller bekræftede tilstedeværelsen af næsten rene amyloidfibriller. Immunogoldmærkning bekræftede også tilstedeværelsen af amyloid beta-42 peptider. Farvning ved hjælp af anti-amyloid beta-42 og anti-fibril antistoffer viste en relativ overflod af amyloid beta-42 peptider i fibriller.Rensede amyloidfraktioner viste tilstedeværelsen af ca. 250 proteiner, mens fraktionen opsamlet før ultralydbehandling og SDS-vask indeholdt mere end 2.500 proteiner. Fibrilkerner viste berigelse af proteiner forbundet med ikke-membranbundne organeller og supramolekylære komplekser. Amyloider er arter med lav overflod, måske et par piktogrammer til få mikrogram pr. Milligram hjernevæv.Så du skal være meget forsigtig, mens du samler lagene, pallerne op eller kasserer supernatanten. Med udviklingen af denne teknik kan du nu mere trygt identificere proteiner forbundet med de indledende amyloidfrø, karakterisere deres struktur og målrette dem til terapeutisk intervention. Derfor forhindrer begyndelsen af denne dødelige sygdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk Karakterisering af Brain-implanterede Microdevices og det omgivende væv

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktisk Infusion af Oligomert amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Oprensning af musehjerne Fartøjer

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toksicitet og Neurodegeneration i voksen zebrafisk hjerne

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisering af Amyloid β indskud i den menneskelige hjerne med Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation Imaging massespektrometri

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rensning af den dendritiske Filopodia-rige fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Mærkning og billeddannelse af amyloid plaques i hjernevæv ved hjælp af den naturlige polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...