Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie R01AG061865 aan R.J.V. en J.N.S. De auteurs bedanken Vassar en Savas onderzoeksgroepsleden aan de Northwestern University voor hun doordachte discussies. We bedanken dr(en) ook oprecht. Ansgar Seimer en Ralf Langen van de University of South California voor hun cruciale inbreng. We bedanken Dr. Farida Korabova voor monstervoorbereiding en negatieve kleuring elektronenmicroscopie beeldvorming aan het Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Dit protocol omvat het gebruik van menselijke of gewervelde hersenweefsels. Al het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde institutionele richtlijnen van de Northwestern University. De huidige workflow is gestandaardiseerd met behulp van APP-knock-in (AppNL-G-F/NL-G-F) hersenschors- en hippocampus hersengebiedextractenvan muizen 11. Dit protocol is geoptimaliseerd voor hersenextracten van muizen op de leeftijd van 6-9 maanden en kan amyloïden van zowel...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Het ontwikkelen van een duidelijk begrip van de amyloïde structuur en samenstelling is een uitdaging voor structurele biologen en biochemici vanwege de biologische complexiteit en experimentele beperkingen bij het extraheren van gezuiverde fibrillen uit AD-hersenweefsels16,17. Amyloïde fibrillen zijn polymorf op moleculair niveau en vertonen een heterogene populatie van verschillende lengtes en complexiteiten18,19<sup class="x...

Amyloïde is een extreem stabiele supramoleculaire opstelling die wordt aangetroffen in een divers panel van eiwitten, waarvan sommige leiden tot pathologische veranderingen1. De accumulatie van intra- of extracellulaire amyloïde aggregaten wordt waargenomen bij verschillende neurodegeneratieve ziekten2. Amyloïde aggregaten zijn heterogeen en verrijkt met een groot aantal eiwitten en lipiden3. In de afgelopen jaren heeft de interesse in het amyloïde proteoom aanzienlijke interesse gewekt onder basis- en translationele neurowetenschappers. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om amyloïde aggregaten uit menselijke hersenweefsels van muizen en postmortems te extraheren en te zuiveren. Laser-capture microdissectie, immunoprecipitatie, decellularisatie en biochemische isolatie van amyloïde aggregaten zijn veelgebruikte methoden om amyloïde plaques, fibrillen en oligomerente extraheren en te zuiveren 4,5,6,7. Veel van deze studies hebben zich gericht op het bepalen van de eiwitsamenstelling van deze dicht opeengepakte fibrillaire afzettingen met behulp van semi-kwantitatieve MS. De beschikbare resultaten zijn echter inconsistent en het verrassend grote aantal co-zuiverende eiwitten dat eerder werd gerapporteerd, is een uitdaging om te interpreteren.
De primaire beperking van de bestaande literatuur die het amyloïde kernproteoom in AD- en AD-muizenmodelhersenen beschrijft, is dat het gezuiverde materiaal een onbeheersbaar aantal co-zuiverende eiwitten bevat. Het algemene doel van deze methode is om deze beperking te overwinnen en een robuuste biochemische zuivering te ontwikkelen voor het isoleren van amyloïde fibrilkernen. Deze strategie maakt gebruik van een eerder beschreven sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie-gebaseerde biochemische methode voor de isolatie van SDS onoplosbare verrijkte amyloïde fracties uit post-mortem AD menselijke en muis hersenweefsels 8,9. Deze methode bouwt voort op de bestaande literatuur, maar gaat verder met ultrasoonbehandeling en SDS-wasbeurten om de meeste losjes gebonden amyloïde-geassocieerde eiwitten te verwijderen, wat leidt tot de isolatie van sterk gezuiverde amyloïde fibrillen (figuur 1). De fibrillen die door dit protocol worden gezuiverd, overwinnen verschillende bestaande uitdagingen die vaak worden aangetroffen in structurele studies van amyloïde fibrillen geïsoleerd uit hersenextracten. Visualisatie van deze fibrillen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bevestigt de integriteit en zuiverheid van het gezuiverde materiaal (figuur 2). In deze studie worden de geïsoleerde fibrillen opgelost en verteerd tot peptiden met trypsine, en labelvrije MS-analyse kan gemakkelijk de identiteit onthullen van de eiwitten die de fibrilkern vormen. Met name sommige van deze eiwitten hebben een inherente neiging om supramoleculaire assemblages te vormen in niet-membraangebonden organellen. Bovendien zijn veel van de eiwitten die zijn geïdentificeerd in de analyse van amyloïde-bèta (Aβ) fibrillen ook geassocieerd met andere neurodegeneratieve ziekten, wat suggereert dat deze eiwitten een sleutelrol kunnen spelen bij meerdere proteïnopathieën.
Het is onwaarschijnlijk dat deze SDS / ultrasone methode de structuur van de fibrilkernen zal veranderen of verstoren. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor een breed scala aan top-down en bottom-up proteomische analysebenaderingen en aanvullende ms-gebaseerde structurele analysestrategieën, zoals chemische crosslinking of waterstof-deuteriumuitwisseling. Het totale herstel met behulp van deze methode is relatief hoog en is dus geschikt voor gedetailleerde structurele studies, waarvoor microgram tot milligram van het gezuiverde materiaal nodig is. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor structurele studies met cryoEM en atoomkrachtmicroscopie. Dit protocol, in combinatie met de stabiele isotopische etikettering van zoogdieren, kan solid-state nucleaire magnetische resonantie (NMR) studies van amyloïde structuur10 vergemakkelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Eiwithoudende fibrillaire insluitsels zijn belangrijke pathologische kenmerken van meerdere neurodegeneratieve ziekten. In de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer (AD) vormen amyloïde-bètapeptiden protofibrillen in de extracellulaire ruimte, die fungeren als zaden die geleidelijk groeien en rijpen tot grote amyloïde plaques. Ondanks dit basisbegrip is de huidige kennis van de amyloïde fibrilstructuur, samenstelling en afzettingspatronen in de hersenen beperkt. Een belangrijke barrière is het onvermogen om sterk gezuiverde amyloïde fibrillen uit hersenextracten te isoleren. Affiniteitszuivering en laservangst microdissectie-gebaseerde benaderingen zijn eerder gebruikt om amyloïden te isoleren, maar worden beperkt door de kleine hoeveelheid materiaal die kan worden teruggewonnen. Dit nieuwe, robuuste protocol beschrijft de biochemische zuivering van amyloïde plaquekernen met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) oplosbaarheid met sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en ultrasoon geluid en levert zeer zuivere fibrillen van AD-patiënten en AD-model hersenweefsels. Massaspectrometrie (MS) -gebaseerde bottom-up proteomische analyse van het gezuiverde materiaal vertegenwoordigt een robuuste strategie om bijna alle primaire eiwitcomponenten van amyloïde fibrillen te identificeren. Eerdere proteomische studies van eiwitten in de amyloïde coronae hebben een onverwacht grote en functioneel diverse verzameling eiwitten onthuld. Met name na het verfijnen van de zuiveringsstrategie werd het aantal co-zuiverende eiwitten met meer dan 10-voudig verminderd, wat wijst op de hoge zuiverheid van het geïsoleerde SDS-onoplosbare materiaal. Negatieve kleuring en immuno-goud elektronenmicroscopie maakten bevestiging van de zuiverheid van deze preparaten mogelijk. Verdere studies zijn nodig om de ruimtelijke en biologische kenmerken te begrijpen die bijdragen aan de afzetting van deze eiwitten in amyloïde insluitsels. Alles bij elkaar genomen is deze analytische strategie goed gepositioneerd om het begrip van amyloïde biologie te vergroten.

Hier wordt een gedetailleerde methode voor de isolatie en zuivering van amyloïde fibrillen samengevat met behulp van een gemodificeerde sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatiezuiveringsmethode (zie figuur 1). De innovatie in deze methode is de opname van stappen van ultrasoon wassen met behulp van een waterbad sonicatiesysteem gevolgd door SDS-oplosbaarheid, die veel losjes geassocieerde eiwitten verwijdert uit de amyloïde fibrillen die co-zuiveren met de zeer dichte en schone fibril...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.

Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Amyloïde plaques zijn vereist voor de diagnose van de ziekte van Alzheimer. Ze zijn echter niet voldoende. Ondanks dit feit blijven ze raadselachtig, deels als gevolg van uitdagingen bij het karakteriseren van hun inhoud.Ons protocol is zeer efficiënt in het isoleren van amyloïde fibrillen bij hoge zuiverheid en is zeer geschikt voor het begrijpen van de fijne details van structuur en samenstelling. Het kennen van het eiwitgehalte van amyloïde plaques kan helpen bij het identificeren van de doelen van therapeutische interventie die hun accumulatie kunnen vertragen, verstoren of voorkomen. Daarom, het uitstellen van het begin van de ziekte.Deze methode is zeer geschikt voor het extraheren van eiwitafzettingen uit gedegenereerde hersenweefsels en eiwitaggregaten in verschillende andere eiwitroutes. Begin met het plaatsen van een vers ontleed of snap bevroren hersenweefselgebied in een buis van twee milliliter met zes tot acht keramische kralen in vers bereide ijskoude homogenisatiebuffer. Maal vervolgens het weefsel met behulp van een kraalmolenhomogenisator bij 4.000 tpm met twee cycli van 30 seconden aan en uit puls.Voeg nu negen milliliter ijskoude homogenisatiebuffer toe aan de ene milliliter hersenweefselhomogenaat en een buis van 15 milliliter en sluit af met laboratoriumwasfilmstroken. Om een robuuste oplosbaarheid te garanderen, houdt u de buis 's nachts draaiend op vier graden Celsius. Voeg de volgende dag vaste sucrose toe aan de suspensie van het weefselextract tot een uiteindelijke concentratie van 1,2 mol.Meng goed en centrifugeer 250.000 x g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de pellet in twee milliliter homogenisatiebuffer met 1,9 molaire sucrose door trituratie en centrifugeert u bij 125.000 x g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Breng na centrifugeren de bovenste witte vaste laag over naar een verse buis en breng een milliliter ijskoude wasbuffer over door meerdere keren op en neer te aaien.Omdat de pellet ook verrijkt is met amyloïde fibrillen, gooit u de waterige middelste laag weg en combineert u de pellet met de bovenste laag voor een hogere opbrengst. Centrifugeer de gecombineerde fracties bij 8.000 x g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de pellet in één milliliter ijskoude verteringsbuffer en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende drie uur op een vortex.Centrifugeer het monster opnieuw, was de pellet vervolgens tweemaal in één milliliter ijskoude Tris-buffer en centrifugeer opnieuw. Na de tweede wasbeurt resuspenseer je de pellet in één milliliter oplosbuffer door op en neer te pipetteren en centrifugeer je de buis snel bij 200.000 x g gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar de pellet en verlaag vervolgens de sucroseconcentratie van 1,3 naar één kies door 50 millimol Tris-buffer aan het supernatant toe te voegen.Centrifugeer het supernatant opnieuw en los vervolgens beide pellets en 100 microliter Tris-buffer met 0,5% SDS op. Voor amyloïde zuivering, solubiliteer de amyloïde-rijke pellets met behulp van ultrasone golven in een bad sonicatie-apparaat gedurende 20 cycli, en centrifugeer het materiaal onmiddellijk op 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 500 microliter van 0,5% SDS Tris-buffer en herhaal het wassen nog vier keer, Na de laatste centrifugatiestap, was de pellet in 200 microliter ultrapuur water en centrifugeer 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om het resterende reinigingsmiddel te verwijderen.Los de laatste pellet met gezuiverde amyloïde fibrillen op in 100 microliter ultrapuur water. Los de gezuiverde 100 microliter amyloïde fibrillen goed op in 400 microliter methanol en vortex. Meng er vervolgens opnieuw 100 microliter chloroform en vortex door.Voeg vervolgens 300 microliter ultrapuur water toe en vortex grondig. Na centrifugeren bij 12.000 x g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig de bovenste waterige laag zonder de interfacelaag met de eiwitvlok te verstoren en voegt u hetzelfde volume methanol opnieuw toe. Herhaal de centrifugatie, gooi het supernatant weg en droog de pellet aan de lucht.Voor de spijsvertering, los de pellet op in 50 microliter guanidinehydrochloridebuffer en soniceer in een ijskoud waterbad. Vortex vervolgens grondig gedurende 45 minuten tot een uur bij kamertemperatuur, voeg 50 microliter 0,2% oppervlakteactieve oplossing toe en vortex opnieuw gedurende nog eens 60 minuten. Voeg vervolgens een microliter van 500 millimol TCEP toe en incubeer gedurende 60 minuten.Voeg vervolgens twee microliter 500 milliimolar jodoacetamide toe en incubeer in het donker gedurende 20 minuten. Doof na de incubatie het jodoacetamide met vijf microliter TCEP-oplossing gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens het vereiste volume van 50 millimol ammoniumbicarbonaatoplossing toe aan de buis om de guanidineconcentratie te verlagen tot 1,5 mol.Voeg ook 1% oppervlakteactieve oplossing toe aan de buis. Voeg vervolgens trypsine toe en laat de tube een nacht op 37 graden Celsius mengen. Voeg de volgende dag mierenzuur toe aan de verteerde peptideoplossing om de pH te verlagen tot 2,0 en activeer vervolgens de C18-spinkolom door 200 microliter 50% methanoloplossing toe te voegen en gedurende twee minuten bij kamertemperatuur bij 1500 x g te draaien.Breng vervolgens de C18-kolomharsbedden in evenwicht door 200 microliter equilibratiebuffer toe te voegen en opnieuw gedurende twee minuten te draaien. Laad na equilibratie de verzuurde peptideoplossing op de C18-kolom en centrifugeer bij 1500 x g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Laad de stroom opnieuw door, draai de kolom en gooi de tweede stroom weg.Was vervolgens de peptiden gebonden aan de C18-hars tweemaal met de wasbuffer. Eluteer het peptide drie keer door 40 microliter elutiebuffer toe te voegen en de kolom te centrifleren. Droog de peptiden in een snelvacuümconcentrator door de waterige oplossing te verdampen.De droge pellets kunnen enkele weken voor de MS-analyse bij 20 graden Celsius worden bewaard. Congorode kleuring van gezuiverde amyloïden documenteert de verrijking van de amyloïde fibrillen in vergelijking met de SDS-oplosbare fractie. De SDS-oplosbare fractie toonde niet de aanwezigheid van amyloïden.De structuur van de gezuiverde fibrillen bevestigde de aanwezigheid van bijna zuivere amyloïde fibrillen. Ook bevestigde immunogold-etikettering de aanwezigheid van amyloïde bèta-42-peptiden. Kleuring met behulp van anti-amyloïde beta-42 en anti-fibril antilichamen toonde een relatieve overvloed aan amyloïde beta-42 peptiden in fibrillen.Gezuiverde amyloïde fracties toonden de aanwezigheid van ongeveer 250 eiwitten, terwijl de fractie verzameld vóór ultrasoonbehandeling en SDS-was meer dan 2.500 eiwitten bevatte. Fibrilkernen vertoonden verrijking van eiwitten geassocieerd met niet-gemene gebonden organel en supramoleculaire complexen. Amyloïden zijn soorten met een lage abundantie, misschien een paar picogrammen tot enkele microgrammen per milligram hersenweefsel.Je moet dus heel voorzichtig zijn bij het oppakken van de lagen, pallets of het weggooien van het supernatant. Met de ontwikkeling van deze techniek kunt u nu met meer vertrouwen eiwitten identificeren die geassocieerd zijn met de initiële amyloïde zaden, hun structuur karakteriseren en ze richten op therapeutische interventie. Daarom het voorkomen van het begin van deze dodelijke ziekte.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettering en beeldvorming van amyloïde plaques in hersenweefsel met behulp van de natuurlijke Polyphenol curcumine

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...