Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention niH R01AG061865 à R.J.V. et J.N.S. Les auteurs remercient les membres du groupe de recherche Vassar et Savas de l’Université Northwestern pour leurs discussions réfléchies. Nous remercions également sincèrement dr(s). Ansgar Seimer et Ralf Langen de l’Université de Californie du Sud pour leur contribution cruciale. Nous remercions le Dr Farida Korabova pour la préparation des échantillons et l’imagerie par microscopie électronique à coloration négative au Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Ce protocole implique l’utilisation de tissus cérébraux humains ou vertébrés. Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles approuvées par l’Université Northwestern. Le flux de travail actuel est normalisé à l’aide d’extraits corticaux du cerveau de souris et de la région cérébrale de l’hippocampe APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F)11. Ce protocole a été optimisé pour les extraits de cerveau de souris âgées de ...

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	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Développer une compréhension claire de la structure et de la composition amyloïdes est difficile pour les biologistes structuraux et les biochimistes en raison des complexités biologiques et des limites expérimentales dans l’extraction des fibrilles purifiées des tissus cérébraux de laMA 16,17. Les fibrilles amyloïdes sont polymorphes au niveau moléculaire, montrant une population hétérogène de longueurs et de complexités variables<sup class="xref...

L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques1. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives2. Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides3. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire et purifier les agrégats amyloïdes des tissus cérébraux humains de souris et post-mortem. La microdissection par capture laser, l’immunoprécipitation, la décellularisation et l’isolement biochimique des agrégats amyloïdes sont des méthodes largement utilisées pour extraire et purifier les plaques amyloïdes, les fibrilles et les oligomères 4,5,6,7. Beaucoup de ces études se sont concentrées sur la détermination de la composition protéique de ces dépôts fibrillaires étroitement emballés à l’aide de la SEP semi-quantitative. Cependant, les résultats disponibles sont incohérents et le nombre étonnamment élevé de protéines co-purifiantes précédemment rapportées est difficile à interpréter.
La principale limite de la littérature existante décrivant le protéome du noyau amyloïde dans les cerveaux modèles murins AD et AD est que le matériel purifié contient un nombre ingérable de protéines co-purifiantes. L’objectif global de cette méthode est de surmonter cette limitation et de développer une purification biochimique robuste pour isoler les noyaux de fibrilles amyloïdes. Cette stratégie utilise une méthode biochimique basée sur l’ultracentrifugation du gradient de densité de saccharose décrite précédemment pour isoler les fractions amyloïdes enrichies insolubles dans le SDS à partir de tissus cérébraux humains et murins post-mortemAD 8,9. Cette méthode s’appuie sur la littérature existante, mais va plus loin avec les ultrasons et les lavages SDS pour éliminer la plupart des protéines associées à l’amyloïde faiblement liées, conduisant à l’isolement des fibrilles amyloïdes hautement purifiées (Figure 1). Les fibrilles purifiées par ce protocole surmontent plusieurs défis existants fréquemment rencontrés dans les études structurelles de fibrilles amyloïdes isolées à partir d’extraits cérébraux. La visualisation de ces fibrilles par microscopie électronique à transmission (TEM) confirme l’intégrité et la pureté du matériau purifié (Figure 2). Dans cette étude, les fibrilles isolées sont solubilisées et digérées en peptides avec de la trypsine, et l’analyse de la SEP sans étiquette peut facilement révéler l’identité des protéines formant le noyau de la fibrilure. Notamment, certaines de ces protéines ont une tendance inhérente à former des assemblages supramoléculaires dans des organites non liés à la membrane. En outre, de nombreuses protéines identifiées dans l’analyse des fibrilles bêta-amyloïdes (Aβ) sont également associées à d’autres maladies neurodégénératives, ce qui suggère que ces protéines peuvent jouer un rôle clé dans de multiples protéinopathies.
Il est peu probable que cette méthode de FDS/ultrasons modifie ou perturbe la structure des noyaux de fibrilles. Le matériau purifié convient également à un large éventail d’approches d’analyse protéomique descendante et ascendante et à d’autres stratégies d’analyse structurelle basées sur la SEP, telles que la réticulation chimique ou l’échange hydrogène-deutérium. La récupération globale à l’aide de cette méthode est relativement élevée et convient donc aux études structurelles détaillées, qui nécessitent des microgrammes à des milligrammes du matériau purifié. Le matériau purifié convient également aux études structurelles utilisant cryoEM et la microscopie à force atomique. Ce protocole, combiné au marquage isotopique stable des mammifères, peut faciliter les études par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide de la structure amyloïde10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.

Ici, une méthode détaillée pour l’isolement et la purification des fibrilles amyloïdes à l’aide d’une méthode modifiée de purification par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose est résumée (voir la figure 1). L’innovation dans cette méthode est l’inclusion d’étapes de lavage par ultrasons à l’aide d’un système de sonication au bain-marie suivi d’une solubilisation SDS, qui élimine de nombreuses protéines faiblement associées des fibrille...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Les plaques amyloïdes sont nécessaires pour le diagnostic de la maladie d’Alzheimer. Cependant, ils ne sont pas suffisants. Malgré cela, ils restent énigmatiques en partie à cause des difficultés à caractériser leur contenu.Notre protocole est très efficace pour isoler les fibrilles amyloïdes à haute pureté et est bien adapté pour comprendre les détails fins de la structure et de la composition. Connaître la teneur en protéines des plaques amyloïdes peut aider à identifier les cibles d’une intervention thérapeutique qui peuvent retarder, interférer ou empêcher leur accumulation. Par conséquent, retarder l’apparition de la maladie.Cette méthode est bien adaptée à l’extraction de dépôts de protéines à partir de tissus cérébraux dégénérés et d’agrégats de protéines dans différentes autres voies protéiques. Commencez par placer une région de tissu cérébral fraîchement disséquée ou congelée dans un tube de deux millilitres contenant six à huit perles de céramique dans un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé. Ensuite, broyer le tissu à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes à 4 000 tr / min avec deux cycles de 30 secondes sur et hors impulsion.Maintenant, ajoutez neuf millilitres de tampon d’homogénéisation glacé au millilitre d’homogénéat de tissu cérébral et un tube de 15 millilitres et un joint avec des bandes de film de cire de laboratoire. Pour assurer une solubilisation robuste, maintenez le tube en rotation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, ajouter du saccharose solide à la suspension d’extrait tissulaire à une concentration finale de 1,2 mole.Mélangez bien et centrifugez 250 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille dans deux millilitres de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 saccharose molaire en triturant et centrifuger à 125 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, transférer la couche solide blanche supérieure dans un tube frais et solubiliser un millilitre de tampon de lavage à froid en caressant plusieurs fois.Étant donné que la pastille est également enrichie en fibrilles amyloïdes, jetez la couche intermédiaire aqueuse et combinez la pastille avec la couche supérieure pour un rendement plus élevé. Centrifuger les fractions combinées à 8 000 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille dans un millilitre de tampon de digestion glacé et incubez à température ambiante pendant trois heures sur un vortex.Centrifugez à nouveau l’échantillon, puis lavez la pastille deux fois dans un millilitre de tampon Tris glacé et centrifugez à nouveau. Après le deuxième lavage, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de solubilisation en pipetant de haut en bas et centrifugez rapidement le tube à 200 000 x g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. Économisez la pastille, puis réduisez la concentration de saccharose de 1,3 à une molaire en ajoutant un tampon Tris de 50 millimolaires au surnageant.Centrifugez à nouveau le surnageant, puis dissolvez les deux pastilles et 100 microlitres de tampon Tris contenant 0,5% de FDS. Pour la purification amyloïde, solubilisez les pastilles riches en amyloïde à l’aide d’ondes ultrasonores dans un dispositif de sonication de bain pendant 20 cycles, puis centrifugez immédiatement le matériau à 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Remettre la pastille dans 500 microlitres de tampon Tris à 0,5% SDS et répéter le lavage quatre fois de plus, Après l’étape finale de centrifugation, laver la pastille dans 200 microlitres d’eau ultrapure et centrifuger 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer tout détergent restant.Dissoudre la pastille finale contenant des fibrilles amyloïdes purifiées dans 100 microlitres d’eau ultrapure. Dissoudre les 100 microlitres purifiés de fibrilles amyloïdes dans 400 microlitres de méthanol et bien vortex. Ensuite, mélangez à nouveau 100 microlitres de chloroforme et de vortex.Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’eau ultrapure et de vortex à fond. Après centrifugation à 12 000 x g pendant deux minutes à température ambiante, retirer soigneusement la couche aqueuse supérieure sans perturber la couche d’interface contenant le flocon de protéine et ajouter à nouveau le même volume de méthanol. Répétez la centrifugation, jetez le surnageant et séchez la pastille à l’air.Pour la digestion, dissoudre la pastille dans 50 microlitres de tampon de chlorhydrate de guanidine et sonicate dans un bain d’eau glacée. Ensuite, vortexez abondamment pendant 45 minutes à une heure à température ambiante, ajoutez 50 microlitres de solution de tensioactif à 0,2% et vortexez à nouveau pendant 60 minutes supplémentaires. Ensuite, ajoutez un microlitre de TCEP de 500 millimolaires et incubez pendant 60 minutes.Ajoutez ensuite deux microlitres d’iodoacétamide de 500 millimolaires et incubez dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après l’incubation, tremper l’iodoacétamide avec cinq microlitres de solution de TCEP pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez le volume requis de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires au tube pour réduire la concentration de guanidine à 1,5 mole.Ajoutez également une solution de tensioactif à 1% dans le tube. Ensuite, ajoutez la trypsine et laissez le tube mélanger à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez de l’acide formique à la solution peptidique digérée pour abaisser le pH à 2,0, puis activez la colonne de spin C18 en ajoutant 200 microlitres de solution de méthanol à 50% et en filant à 1500 x g pendant deux minutes à température ambiante.Ensuite, équilibrez les lits de résine de colonne C18 en ajoutant 200 microlitres de tampon d’équilibrage et en tournant à nouveau pendant deux minutes. Après équilibrage, charger la solution peptidique acidifiée sur la colonne C18 et centrifuger à 1500 x g pendant deux minutes à température ambiante. Rechargez le flux à travers, faites tourner la colonne et jetez le deuxième flux à travers.Ensuite, lavez les peptides liés à la résine C18 deux fois avec le tampon de lavage. Éluez le peptide trois fois en ajoutant 40 microlitres de tampon d’élution et en centrifugant la colonne. Sécher les peptides dans un concentrateur à vide rapide en évaporant la solution aqueuse.Les granulés secs peuvent être conservés à 20 degrés Celsius pendant quelques semaines avant l’analyse de la SEP. La coloration rouge Congo des amyloïdes purifiées documente l’enrichissement des fibrilles amyloïdes par rapport à la fraction soluble SDS. La fraction soluble SDS n’a pas montré la présence d’amyloïdes.La structure des fibrilles purifiées a confirmé la présence de fibrilles amyloïdes presque pures. En outre, le marquage immunogold a confirmé la présence de peptides bêta-42 amyloïdes. La coloration à l’aide d’anticorps anti-bêta-amyloïde bêta-42 et anti-fibrilles a montré une abondance relative de peptides bêta-42 amyloïdes dans les fibrilles.Les fractions amyloïdes purifiées ont montré la présence d’environ 250 protéines, tandis que la fraction recueillie avant les ultrasons et le lavage SDS contenait plus de 2 500 protéines. Les noyaux de fibrilles ont montré un enrichissement en protéines associées à des organites non liés aux membranes et aux complexes supramoléculaires. Les amyloïdes sont des espèces de faible abondance, peut-être quelques picogrammes à quelques microgrammes par milligramme de tissus cérébraux.Vous devez donc être très prudent lorsque vous ramassez les couches, les palettes ou jetez le surnageant. Avec le développement de cette technique, vous pouvez maintenant identifier avec plus de confiance les protéines associées aux graines amyloïdes initiales, caractériser leur structure et les cibler pour une intervention thérapeutique. Par conséquent, prévenir l’apparition de cette maladie mortelle.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Sélection d&#39;aptamères pour amyloïde β-protéine, l&#39;agent causal de la maladie d&#39;Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Recherche

Neurosciences

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purification de souris vaisseaux cérébraux

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisation des dépôts β-amyloïde dans le cerveau humain avec Laser assistée par matrice désorption-ionisation d’imagerie de la spectrométrie de masse

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Étiquetage et imagerie des plaques amyloïdes dans les tissus cérébraux à l'aide de la curcumine polyphénol naturelle

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...