Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01AG061865 an R.J.V. und J.N.S. unterstützt. Die Autoren danken Vassar und den Mitgliedern der Savas-Forschungsgruppe an der Northwestern University für ihre nachdenklichen Diskussionen. Wir danken auch herzlich Dr. s. Ansgar Seimer und Ralf Langen von der University of South California für ihren entscheidenden Input. Wir danken Dr. Farida Korabova für die Probenvorbereitung und die Bildgebung negativer Färbeelektronenmikroskopie am Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichem oder wirbeltierischem Hirngewebe. Die gesamte Forschung wurde in Übereinstimmung mit den genehmigten institutionellen Richtlinien der Northwestern University durchgeführt. Der aktuelle Workflow wird mit APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) Mouse brain cortikical und hippocampal brain region extracts11 standardisiert. Dieses Protokoll wurde für Gehirnextrakte von Mäusen im Alter von 6-9 Monaten optimiert und kann Amyloi...

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	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Die Entwicklung eines klaren Verständnisses der Struktur und Zusammensetzung von Amyloiden ist für Strukturbiologen und Biochemiker aufgrund der biologischen Komplexität und der experimentellen Einschränkungen bei der Extraktion gereinigter Fibrillen aus AD-Hirngewebeneine Herausforderung 16,17. Amyloidfibrillen sind auf molekularer Ebene polymorph und zeigen eine heterogene Population unterschiedlicher Länge und Komplexität18,19<sup...

Amyloid ist eine extrem stabile supramolekulare Anordnung, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommt, von denen einige zu pathologischen Veränderungen führen1. Die Akkumulation von intra- oder extrazellulären Amyloidaggregaten wird bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungenbeobachtet 2. Amyloid-Aggregate sind heterogen und mit einer Vielzahl von Proteinen und Lipiden angereichert3. In den letzten Jahren hat das Interesse am Amyloid-Proteom bei grundlegenden und translationalen Neurowissenschaftlern ein erhebliches Interesse geweckt. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Amyloidaggregate aus Maus- und postmortalem menschlichem Hirngewebe zu extrahieren und zu reinigen. Laser-Capture-Mikrodissektion, Immunpräzipitation, Dezellularisierung und biochemische Isolierung von Amyloid-Aggregaten sind weit verbreitete Methoden zur Extraktion und Reinigung von Amyloid-Plaques, Fibrillen und Oligomeren 4,5,6,7. Viele dieser Studien haben sich darauf konzentriert, die Proteinzusammensetzung dieser dicht gepackten fibrillären Ablagerungen unter Verwendung von semiquantitativer MS zu bestimmen. Die verfügbaren Ergebnisse sind jedoch inkonsistent, und die überraschend große Anzahl von Co-Cleanifying-Proteinen, die zuvor berichtet wurden, sind schwierig zu interpretieren.
Die primäre Einschränkung der bestehenden Literatur, die das Amyloidkernproteom in AD- und AD-Mausmodellgehirnen beschreibt, besteht darin, dass das gereinigte Material eine unüberschaubare Anzahl von mitreinigenden Proteinen enthält. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, diese Einschränkung zu überwinden und eine robuste biochemische Reinigung zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen zu entwickeln. Diese Strategie verwendet eine zuvor beschriebene auf Succharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende biochemische Methode zur Isolierung von SDS-unlöslichen angereicherten Amyloidfraktionen aus postmortalem AD-Hirngewebevon Menschen und Mäusen 8,9. Diese Methode baut auf der vorhandenen Literatur auf, geht aber mit Ultraschall und SDS-Waschungen weiter, um die meisten der lose gebundenen Amyloid-assoziierten Proteine zu entfernen, was zur Isolierung von hochgereinigten Amyloidfibrillen führt (Abbildung 1). Die durch dieses Protokoll gereinigten Fibrillen überwinden mehrere bestehende Herausforderungen, die häufig in Strukturstudien von Amyloidfibrillen auftreten, die aus Gehirnextrakten isoliert wurden. Die Visualisierung dieser Fibrillen mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt die Integrität und Reinheit des gereinigten Materials (Abbildung 2). In dieser Studie werden die isolierten Fibrillen mit Trypsin gelöst und zu Peptiden verdaut, und eine markierungsfreie MS-Analyse kann die Identität der Proteine, die den Fibrillenkern bilden, leicht aufdecken. Insbesondere haben einige dieser Proteine eine inhärente Tendenz, supramolekulare Anordnungen in nicht membrangebundenen Organellen zu bilden. Darüber hinaus sind viele der Proteine, die bei der Analyse von Amyloid-Beta (Aβ)-Fibrillen identifiziert wurden, auch mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine eine Schlüsselrolle bei multiplen Proteinopathien spielen können.
Es ist unwahrscheinlich, dass diese SDS / Ultraschallmethode die Struktur der Fibrillenkerne verändert oder stört. Das gereinigte Material eignet sich auch für eine Vielzahl von Top-down- und Bottom-up-Proteomanalyseansätzen und zusätzlichen MS-basierten Strukturanalysestrategien, wie chemische Vernetzung oder Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Die Gesamtausbeute mit dieser Methode ist relativ hoch und eignet sich daher für detaillierte Strukturuntersuchungen, die Mikrogramm bis Milligramm des gereinigten Materials erfordern. Das gereinigte Material eignet sich auch für Strukturuntersuchungen mittels KryoEM und Rasterkraftmikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit der stabilen Isotopenmarkierung von Säugetieren Festkörper-Kernspinresonanzuntersuchungen (NMR) derAmyloidstruktur 10 erleichtern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Proteinaceous fibrilläre Einschlüsse sind wichtige pathologische Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen. In den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) bilden Amyloid-Beta-Peptide Protofibrillen im extrazellulären Raum, die als Samen fungieren, die allmählich wachsen und zu großen Amyloid-Plaques reifen. Trotz dieses grundlegenden Verständnisses ist das derzeitige Wissen über die Struktur, Zusammensetzung und Ablagerungsmuster von Amyloidfibrillen im Gehirn begrenzt. Eine Hauptbarriere war die Unfähigkeit, hochgereinigte Amyloidfibrillen aus Gehirnextrakten zu isolieren. Affinitätsreinigungs- und Lasereinfang-Mikrodissektions-basierte Ansätze wurden bisher zur Isolierung von Amyloiden verwendet, sind jedoch durch die geringe Menge an Material, die zurückgewonnen werden kann, begrenzt. Dieses neuartige, robuste Protokoll beschreibt die biochemische Reinigung von Amyloid-Plaquekernen unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat (SDS) -Solubilisierung mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Ultraschall und liefert hochreine Fibrillen von AD-Patienten und AD-Modell-Hirngeweben. Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende proteomische Bottom-up-Proteomanalyse des gereinigten Materials stellt eine robuste Strategie zur Identifizierung fast aller primären Proteinkomponenten von Amyloidfibrillen dar. Frühere proteomische Studien von Proteinen in der Amyloidkorone haben eine unerwartet große und funktionell vielfältige Sammlung von Proteinen ergeben. Insbesondere wurde nach der Verfeinerung der Reinigungsstrategie die Anzahl der mitreinigenden Proteine um mehr als das 10-fache reduziert, was auf die hohe Reinheit des isolierten unlöslichen SDS-Materials hinweist. Negative Färbung und Immun-Gold-Elektronenmikroskopie ermöglichten die Bestätigung der Reinheit dieser Präparate. Weitere Studien sind erforderlich, um die räumlichen und biologischen Eigenschaften zu verstehen, die zur Ablagerung dieser Proteine in Amyloideinschlüsse beitragen. Zusammengenommen ist diese analytische Strategie gut positioniert, um das Verständnis der Amyloidbiologie zu verbessern.

Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amyloidfibrillen unter Verwendung eines modifizierten Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugationsreinigungsverfahrens zusammengefasst (siehe Abbildung 1). Die Innovation bei dieser Methode ist die Einbeziehung von Schritten des ultraschallbasierten Waschens mit einem Wasserbadbeschallungssystem, gefolgt von einer SDS-Solubilisierung, die viele lose assoziierte Proteine aus den Amyloidfibrillen entfernt, die mit den ho...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Amyloid-Plaques sind für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit erforderlich. Sie sind jedoch nicht ausreichend. Trotz dieser Tatsache bleiben sie rätselhaft, was zum Teil auf die Herausforderungen bei der Charakterisierung ihres Inhalts zurückzuführen ist.Unser Protokoll ist hocheffizient bei der Isolierung von Amyloidfibrillen bei hoher Reinheit und eignet sich gut, um die feinen Details von Struktur und Zusammensetzung zu verstehen. Die Kenntnis des Proteingehalts von Amyloid-Plaques kann helfen, die Ziele der therapeutischen Intervention zu identifizieren, die ihre Ansammlung verzögern, stören oder verhindern können. Daher verzögert sich der Ausbruch der Krankheit.Diese Methode eignet sich gut zur Extraktion von Proteinablagerungen aus degeneriertem Hirngewebe und Proteinaggregaten in verschiedenen anderen Proteinwegen. Beginnen Sie damit, eine frisch sezierte oder eingefrorene Hirngeweberegion in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit sechs bis acht Keramikperlen in frisch zubereiteten eiskalten Homogenisierungspuffer zu legen. Mahlen Sie dann das Gewebe mit einem Rührwerkshomogenisator bei 4.000 U / min mit zwei Zyklen von 30 Sekunden Ein- und Ausschaltimpuls.Nun neun Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem einen Milliliter Hirngewebehomogenat und einem 15 Milliliter Tubus hinzufügen und mit Laborwachsstreifen versiegeln. Um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten, lassen Sie das Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius rotieren. Am folgenden Tag fügen Sie der Gewebeextraktsuspension feste Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 1,2 Mol hinzu.Gut mischen und Zentrifuge hatte 250.000 x g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in zwei Milliliter Homogenisierungspuffer mit 1,9 molaren Saccharose durch Verreitration resuspendiert und bei 125.000 x g 45 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach der Zentrifugation die oberste weiße feste Schicht in ein frisches Röhrchen überführen und einen Milliliter Eiskaltwaschpuffer durch mehrmaliges Auf- und Abstreichen lösen.Da das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert ist, entsorgen Sie die wässrige Mittelschicht und kombinieren Sie das Pellet mit der obersten Schicht für eine höhere Ausbeute. Die kombinierten Fraktionen bei 8.000 x g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Eiskaltaufschlusspuffer und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für drei Stunden auf einem Wirbel.Zentrifugieren Sie die Probe erneut, waschen Sie das Pellet dann zweimal in einem Milliliter eiskaltem Tris-Puffer und zentrigieren Sie erneut. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in einem Milliliter Solubilisierungspuffer durch Pipettieren auf und ab resuspendieren und das Röhrchen bei 200.000 x g für 60 Minuten bei vier Grad Celsius schnell zentrifugieren. Speichern Sie das Pellet und reduzieren Sie dann die Saccharosekonzentration von 1,3 auf einen Mol, indem Sie dem Überstand 50 millimolar Tris-Puffer hinzufügen.Zentrifen Sie den Überstand erneut und lösen Sie dann beide Pellets und 100 Mikroliter Tris-Puffer mit 0,5% SDS auf. Zur Amyloidreinigung die amyloidreichen Pellets mit Ultraschallwellen in einem Badbeschallungsgerät für 20 Zyklen löseln und das Material dann sofort bei 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern 0,5% SDS Tris-Puffer und wiederholen Sie das Waschen vier weitere Male, Nach dem letzten Zentrifugationsschritt waschen Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Reinstwasser und zentrifugieren Sie 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um das verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen.Lösen Sie das endgültige Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen in 100 Mikrolitern Reinstwasser auf. Die gereinigten 100 Mikroliter Amyloidfibrillen werden in 400 Mikrolitern Methanol und Wirbelgut gelöst. Dann 100 Mikroliter Chloroform und Wirbel noch einmal untermischen.Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie gründlich vor. Nach der Zentrifugation bei 12.000 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur die oberste wässrige Schicht vorsichtig entfernen, ohne die Grenzschicht, die die Proteinflocke enthält, zu stören, und das gleiche Volumen Methanol erneut zugeben. Wiederholen Sie die Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft.Für die Verdauung lösen Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Guanidinhydrochloridpuffer auf und beschallen Sie es in einem eiskalten Wasserbad. Dann gründlich für 45 Minuten bis eine Stunde bei Raumtemperatur vorwirbeln, 50 Mikroliter 0,2% Tensidlösung hinzufügen und erneut für weitere 60 Minuten vorwirbeln. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 500 Millimolar TCEP hinzu und inkubieren Sie für 60 Minuten.Dann fügen Sie zwei Mikroliter 500 millimolar Jodacetamid hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln für 20 Minuten. Nach der Inkubation das Jodacetamid mit fünf Mikrolitern TCEP-Lösung für 15 Minuten abschrecken. Als nächstes fügen Sie das erforderliche Volumen von 50 Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung in das Röhrchen ein, um die Guanidinkonzentration auf 1,5 Mol zu reduzieren.Fügen Sie auch 1% ige Tensidlösung in das Röhrchen hinzu. Dann Trypsin hinzufügen und die Röhre über Nacht bei 37 Grad Celsius mischen lassen. Am nächsten Tag fügen Sie Ameisensäure zu der verdauten Peptidlösung hinzu, um den pH-Wert auf 2,0 zu senken, aktivieren Sie dann die C18-Spinsäule, indem Sie 200 Mikroliter 50% Methanollösung hinzufügen und bei 1500 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur drehen.Als nächstes gleichen Sie die C18-Säulenharzbetten aus, indem Sie 200 Mikroliter Gleichgewichtspuffer hinzufügen und sich zwei Minuten lang erneut drehen. Nach dem Ausgleich die angesäuerte Peptidlösung auf die C18-Säule geben und bei Raumtemperatur zwei Minuten lang bei 1500 x g zentrifugieren. Laden Sie den Durchfluss neu, drehen Sie die Säule, und verwerfen Sie den zweiten Durchfluss.Dann waschen Sie die an das C18-Harz gebundenen Peptide zweimal mit dem Waschpuffer. Elutien Sie das Peptid dreimal, indem Sie 40 Mikroliter Elutionspuffer hinzufügen und die Säule zentrifugieren. Trocknen Sie die Peptide in einem Geschwindigkeits-Vakuumkonzentrator, indem Sie die wässrige Lösung verdampfen.Die trockenen Pellets können vor der MS-Analyse einige Wochen bei 20 Grad Celsius gelagert werden. Die kongolesrote Färbung von gereinigten Amyloiden dokumentiert die Anreicherung der Amyloidfibrillen im Vergleich zur SDS-löslichen Fraktion. Die lösliche SDS-Fraktion zeigte nicht das Vorhandensein von Amyloiden.Die Struktur der gereinigten Fibrillen bestätigte das Vorhandensein von fast reinen Amyloidfibrillen. Auch die Immungoldmarkierung bestätigte das Vorhandensein von Amyloid-beta-42-Peptiden. Die Färbung mit Anti-Amyloid-Beta-42- und Anti-Fibrillen-Antikörpern zeigte eine relative Häufigkeit von Amyloid-beta-42-Peptiden in Fibrillen.Gereinigte Amyloidfraktionen zeigten das Vorhandensein von etwa 250 Proteinen, während die vor Ultraschall und SDS-Waschung gesammelte Fraktion mehr als 2.500 Proteine enthielt. Fibrillenkerne zeigten eine Anreicherung von Proteinen, die mit nichtmembrangebundenen Organellen und supramolekularen Komplexen assoziiert sind. Amyloide sind Arten mit geringer Häufigkeit, vielleicht ein paar Pikogramme bis wenige Mikrogramm pro Milligramm Hirngewebe.Sie müssen also sehr vorsichtig sein, wenn Sie die Lagen, Paletten oder den Überstand abholen. Mit der Entwicklung dieser Technik können Sie nun Proteine, die mit den ursprünglichen Amyloidsamen assoziiert sind, sicherer identifizieren, ihre Struktur charakterisieren und sie für therapeutische Interventionen ansprechen. Daher wird der Ausbruch dieser tödlichen Krankheit verhindert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...