Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AG061865 ל- R.J.V. ו- J.N.S. המחברים מודים לחברי קבוצת המחקר ואסאר וסאבאס באוניברסיטת נורת'ווסטרן על דיוניהם המהורהרים. אנו גם מודים מקרב לב לד"ר(ים). אנסגאר סימר וראלף לאנגן באוניברסיטת דרום קליפורניה על התשומות המכריעות שלהם. אנו מודים לד"ר פארידה קורבובה על הכנת דגימות והדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים מכתימה שלילית במרכז למיקרוסקופיה מתקדמת של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

פרוטוקול זה כולל שימוש ברקמות מוח של בני אדם או בעלי חוליות. כל המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות של אוניברסיטת נורת'ווסטרן. זרימת העבודה הנוכחית מתוקננת באמצעות APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) של המוח של העכברים קליפת המוח ואזור המוח בהיפוקמפוסמחלץ 11. פרוטוקול זה עבר א...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

פיתוח הבנה ברורה של המבנה וההרכב של עמילואידים מאתגר עבור ביולוגים מבניים וביוכימאים בשל המורכבות הביולוגית והמגבלות הניסוייות בחילוץ פיברילים מטוהרים מרקמות מוח AD 16,17. סיבי עמילואיד הם פולימורפיים ברמה המולקולרית, ומראים אוכלוסייה הטרוגנית באורכים ובמ?...

עמילואיד הוא סידור סופראמולקולרי יציב ביותר שנמצא בפאנל מגוון של חלבונים, שחלקם מובילים לשינויים פתולוגיים1. הצטברות של אגרגטים עמילואידיים תוך או חוץ-תאיים נצפית במספר מחלות נוירודגנרטיביות2. אגרגטי עמילואיד הם הטרוגניים ומועשרים במספר רב של חלבונים ושומנים3. בשנים האחרונות, העניין בפרוטאום העמילואידי עורר עניין רב בקרב מדעני מוח בסיסיים ותרגומים. מספר שיטות פותחו כדי לחלץ ולטהר אגרגטים עמילואידיים מרקמות מוח אנושיות של עכברים ופוסט-מורטם. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, מיצוי חיסוני, דה-תאיזציה ובידוד ביוכימי של אגרגטים עמילואידיים הן שיטות נפוצות לחילוץ וטיהור של פלאקים עמילואידים, פיברילים ואוליגומרים 4,5,6,7. רבים מהמחקרים האלה התמקדו בקביעת הרכב החלבון של מרבצי הפיברילארים הדחוסים האלה באמצעות טרשת נפוצה כמותית למחצה. עם זאת, התוצאות הזמינות אינן עקביות, והמספר הגדול באופן מפתיע של חלבונים המטהרים יחד שדווחו בעבר מאתגר לפענוח.
המגבלה העיקרית של הספרות הקיימת המתארת את הפרוטאום של ליבת העמילואיד במוחות של עכברי AD ו-AD היא שהחומר המטוהר מכיל מספר בלתי ניתן לניהול של חלבונים המטהרים יחד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להתגבר על מגבלה זו ולפתח טיהור ביוכימי חזק לבידוד ליבות פיבריל עמילואידיות. אסטרטגיה זו משתמשת בשיטה ביוכימית מבוססת אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות סוכרוז שתוארה קודם לכן לבידוד של שברים עמילואידים מועשרים בלתי מסיסים של SDS מרקמות מוח של אדם ועכבר AD שלאחר המוות 8,9. שיטה זו מתבססת על הספרות הקיימת, אך מרחיקת לכת יותר עם אולטרה-סוניזציה ושטיפות SDS כדי להסיר את רוב החלבונים הקשורים לעמילואיד הקשורים באופן רופף, מה שמוביל לבידוד של סיבי עמילואיד מטוהרים מאוד (איור 1). הפיברילים המטוהרים על ידי פרוטוקול זה מתגברים על מספר אתגרים קיימים שנתקלים בהם לעתים קרובות במחקרים מבניים של סיבי עמילואיד המבודדים מתמציות מוח. הדמיה של הפיברילים האלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מאשרת את השלמות והטוהר של החומר המטוהר (איור 2). במחקר זה, הפיברילים המבודדים עוברים בדידות ומעוכלים לפפטידים עם טריפסין, וניתוח טרשת נפוצה ללא תווית יכול לחשוף בקלות את זהות החלבונים היוצרים את ליבת הפיבריל. יש לציין כי לחלק מחלבונים אלה יש נטייה מובנית ליצור מכלולים סופראמולקולריים באברונים שאינם קשורים לממברנה. בנוסף, רבים מהחלבונים שזוהו בניתוח של פיברילי עמילואיד-בטא (Aβ) קשורים גם למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, מה שמרמז על כך שחלבונים אלה עשויים למלא תפקיד מפתח בפרוטאינופתיות מרובות.
סביר להניח ששיטת SDS/אולטרה-סוניקציה זו לא תשנה או תשבש את מבנה ליבות הפיבריל. החומר המטוהר מתאים גם למגוון רחב של גישות אנליזה פרוטאומיות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה ולאסטרטגיות ניתוח מבניות נוספות המבוססות על טרשת נפוצה, כגון הצלבה כימית או חילופי מימן-דאוטריום. ההתאוששות הכוללת בשיטה זו גבוהה יחסית, ולכן מתאימה למחקרים מבניים מפורטים, הדורשים מיקרוגרם למיליגרם של החומר המטוהר. החומר המטוהר מתאים גם למחקרים מבניים באמצעות cryoEM ומיקרוסקופיית כוח אטומי. פרוטוקול זה, בשילוב עם התווית האיזוטופית היציבה של יונקים, יכול להקל על מחקרי תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (NMR) של מבנה עמילואיד10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

תכלילי פיברילאר חלבוניים הם סימני היכר פתולוגיים מרכזיים של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות. בשלבים המוקדמים של מחלת האלצהיימר (AD), פפטידים עמילואיד-בטא יוצרים פרוטופיברילים במרחב החוץ-תאי, המשמשים כזרעים הגדלים בהדרגה ומתבגרים לתוך פלאקים גדולים של עמילואיד. למרות ההבנה הבסיסית הזו, הידע הנוכחי על מבנה העמילואיד פיבריל, הרכב ודפוסי התצהיר במוח מוגבל. אחד המחסומים העיקריים היה חוסר היכולת לבודד פיברילי עמילואיד מטוהרים מאוד מתמציות מוח. גישות מבוססות מיקרו-דיסקציה של טיהור זיקה ולכידת לייזר שימשו בעבר לבידוד עמילואידים, אך הן מוגבלות על ידי הכמות הקטנה של החומר שניתן לשחזר. פרוטוקול חדשני וחזק זה מתאר את הטיהור הביוכימי של ליבות פלאק עמילואיד באמצעות סולוביליזציה של נתרן דודציל סולפט (SDS) עם אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות סוכרוז ואולטרה-סוניקציה, ומניב פיברילים טהורים ביותר מחולי AD ומדגמי AD רקמות מוח. ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה (MS) מלמטה למעלה של החומר המטוהר מייצג אסטרטגיה חזקה לזיהוי כמעט כל מרכיבי החלבון העיקריים של פיברילי עמילואיד. מחקרים פרוטאומיים קודמים על חלבונים בעמילואיד קורונה חשפו אוסף גדול באופן בלתי צפוי ומגוון מבחינה תפקודית של חלבונים. יש לציין כי לאחר זיקוק אסטרטגיית הטיהור, מספר החלבונים המטהרים במשותף הופחת ביותר מפי 10, מה שמעיד על הטוהר הגבוה של החומר הבלתי מסיס SDS המבודד. כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרונים אימונו-זהב אפשרו אישור לטוהר ההכנות הללו. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את התכונות המרחביות והביולוגיות התורמות לתצהיר חלבונים אלה לתכלילי עמילואיד. יחד, אסטרטגיה אנליטית זו ממוקמת היטב כדי להגביר את ההבנה של ביולוגיה עמילואידית.

כאן מסוכמת שיטה מפורטת לבידוד וטיהור של פיברילים עמילואידיים באמצעות שיטת טיהור אולטרה-צנטריפוגציה של צפיפות סוכרוז שעברה שינוי (ראו איור 1). החידוש בשיטה זו הוא הכללת שלבים של שטיפה מבוססת אולטרה-סוניקציה באמצעות מערכת סוניקציה של אמבטיית מים ואחריה SDS solubilization, אשר מסירה ...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

פלאקים עמילואיד נדרשים לאבחון מחלת אלצהיימר. עם זאת, הם לא מספיקים. למרות עובדה זו, הם נשארים חידתיים בין היתר בשל אתגרים באפיון תוכנם.הפרוטוקול שלנו יעיל מאוד בבידוד סיבי עמילואיד בטוהר גבוה ומתאים היטב להבנת הפרטים הקטנים של מבנה והרכב. הכרת תכולת החלבון של פלאקים עמילואידיים עשויה לסייע בזיהוי המטרות של התערבות טיפולית שעשויות לעכב, להפריע או למנוע את הצטברותם. לכן, עיכוב הופעת המחלה.שיטה זו מתאימה היטב למיצוי משקעי חלבונים מרקמות מוח מנוונות ומאגרברי חלבונים במסלולים שונים אחרים של חלבונים. התחילו על ידי הצבת אזור רקמת מוח שזה עתה נותח או נצמד בצינור של שני מיליליטר המכיל שישה עד שמונה חרוזי קרמיקה במאגר הומוגניזציה קר כקרח שהוכן זה עתה. לאחר מכן לטחון את הרקמה באמצעות הומוגנייזר טחנת חרוזים ב 4, 000 סל"ד עם שני מחזורים של 30 שניות על דופק לסירוגין.כעת הוסיפו תשעה מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה קר כקרח למיליליטר אחד של רקמת המוח הומוגנטית וצינור 15 מיליליטר ואטם עם רצועות סרט שעווה מעבדתיות. כדי להבטיח סולוביליזציה חזקה, השאירו את הצינור מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מוסיפים סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 שומות.מערבבים היטב וצנטריפוגה היו 250, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להחיות את הכדור בשני מיליליטרים של חיץ הומוגניזציה המכיל 1.9 סוכרוז טוחן על ידי טריטורציה וצנטריפוגה ב 125, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה מעבירים את השכבה הלבנה העליונה לצינור טרי ומבודדים מיליליטר אחד של חיץ שטיפה קר כקרח על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים.מכיוון שהכדור מועשר גם בפיברילי עמילואיד, יש להשליך את השכבה האמצעית המימית ולשלב את הכדור עם השכבה העליונה לקבלת תפוקה גבוהה יותר. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב 8, 000 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנאטנט, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ עיכול קר כקרח ולדוג בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות על מערבולת.צנטריפוגה שוב את הדגימה, ואז לשטוף את הכדור פעמיים במיליליטר אחד של חיץ טריס קר כקרח וצנטריפוגה שוב. לאחר הכביסה השנייה, יש להחיות את הכדור במיליליטר אחד של חיץ סולוביליזציה על ידי צנרת למעלה ולמטה ולצנטריפוגה מהירה של הצינור ב-200, 000 x g במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמרו את הכדור, ואז הפחיתו את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 לטוחנת אחת על ידי הוספת חיץ 50 מילימולאר טריס לסופרנטנט.צנטריפוגה שוב את הסופרנטנט, ואז ממיסים את שני הכדורים ואת 100 המיקרוליטרים של מאגר Tris המכילים 0.5% SDS. עבור טיהור עמילואיד, solubilize את הכדורים העשירים עמילואיד באמצעות גלי אולטרסאונד במכשיר סוניזציה אמבטיה במשך 20 מחזורים, ולאחר מכן מיד צנטריפוגה של החומר ב 20, 000 x g במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שחזרו את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של 0.5% SDS Tris buffer וחזור על הכביסה ארבע פעמים נוספות, לאחר שלב הצנטריפוגה הסופי, שטפו את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מים אולטרה-אפורים וצנטריפוגה 20, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר.ממיסים את הכדור הסופי המכיל סיבי עמילואיד מטוהרים ב-100 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים. ממיסים את 100 המיקרוליטרים המטוהרים של סיבי עמילואיד ב-400 מיקרוליטרים של מתנול ומערבולת היטב. לאחר מכן מערבבים שוב 100 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת.לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מים אולטרה-פוריים ומערבולת ביסודיות. לאחר צנטריפוגה ב 12, 000 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את השכבה מימית העליונה מבלי להפריע את שכבת הממשק המכילה את פתית החלבון ולהוסיף שוב את אותו נפח של מתנול. חזרו על הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הכדור באוויר.לעיכול, ממיסים את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של חיץ גואנידין הידרוכלוריד וסוניקטים באמבט מים קרים כקרח. לאחר מכן מערבולת ביסודיות במשך 45 דקות עד שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תמיסת פעילי שטח של 0.2% ומערבולת שוב למשך 60 דקות נוספות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של 500 millimolar TCEP ולדגום במשך 60 דקות.לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של 500 מילימולר יודואצטאמיד ודגירה בחושך במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מרווים את היודואצטאמיד עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת TCEP למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף את הנפח הנדרש של 50 מילימולר אמוניום bicarbonate תמיסה לצינור כדי להפחית את ריכוז guanidine ל 1.5 שומות.כמו כן, הוסף תמיסת פעילי שטח של 1% לצינור. לאחר מכן מוסיפים טריפסין ומשאירים את הצינור מתערבב ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסיפו חומצה פורמית לתמיסת הפפטיד המעוכלת כדי להוריד את ה-pH ל-2.0, ואז הפעילו את עמודת הספין C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של תמיסת מתנול של 50% וסיבוב ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שיפרו את מצעי השרף של עמוד C18 על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של חיץ שיווי משקל וסיבוב שוב במשך שתי דקות. לאחר שיווי המשקל, טענו את תמיסת הפפטיד החומצי על עמודת C18 ואת הצנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. טען מחדש את הזרימה, סובב את העמודה והשליך את הזרימה השנייה.לאחר מכן יש לשטוף את הפפטידים הקשורים לשרף C18 פעמיים עם מאגר הכביסה. אלקט את הפפטיד שלוש פעמים על ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון וצנטריפוגה בעמודה. מייבשים את הפפטידים ברכז ואקום מהיר על ידי אידוי התמיסה המימית.את הכדורים היבשים ניתן לשמור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני ניתוח הטרשת הנפוצה. הכתם האדום של קונגו של עמילואידים מטוהרים מתעד את העשרת סיבי העמילואיד בהשוואה לחלק המסיס של SDS. השבר המסיס SDS לא הראה נוכחות של עמילואידים.המבנה של הפיברילים המטוהרים אישר את נוכחותם של סיבי עמילואיד כמעט טהורים. כמו כן, תיוג אימונוגולד אישר את נוכחותם של פפטידי עמילואיד בטא-42. צביעה באמצעות נוגדנים נגד עמילואיד בטא-42 ונוגדני אנטי-פיבריל הראתה שפע יחסי של פפטידי עמילואיד בטא-42 בפיברילים.שברי עמילואיד מטוהרים הראו נוכחות של כ-250 חלבונים, בעוד שהשבר שנאסף לפני האולטרה-סוניקציה ושטיפת ה-SDS הכיל יותר מ-2, 500 חלבונים. ליבות פיבריל הראו העשרה של חלבונים הקשורים לקומפלקסים אברוניים וסופראמולקולריים שאינם קשורים ל-mmbrane. עמילואידים הם מינים בעלי שפע נמוך, אולי כמה פיקוגרמות עד כמה מיקרוגרמים למיליגרם של רקמות מוח.אז אתה צריך להיות זהיר מאוד בעת איסוף השכבות, משטחים או השלכת supernatant. עם התפתחות טכניקה זו, כעת ניתן לזהות בביטחון רב יותר חלבונים הקשורים לזרעי העמילואיד הראשוניים, לאפיין את המבנה שלהם ולכוון אותם להתערבות טיפולית. לכן, מניעת הופעת המחלה הקטלנית הזו.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...