Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Gli autori ringraziano i membri del gruppo di ricerca Vassar e Savas della Northwestern University per le loro discussioni ponderate. Ringraziamo sinceramente anche i dottori. Ansgar Seimer e Ralf Langen della University of South California per il loro contributo cruciale. Ringraziamo la dott.ssa Farida Korabova per la preparazione del campione e l'imaging al microscopio elettronico con colorazione negativa presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Questo protocollo prevede l'uso di tessuti cerebrali umani o vertebrati. Tutta la ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali approvate della Northwestern University. L'attuale flusso di lavoro è standardizzato utilizzando APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) mouse cervello corticale e ippocampo cervello e la regione del cervello espopuleestratti 11. Questo protocollo è stato ottimizzato per gli estratti cerebrali di topi a 6-9 mesi di età e può pur...

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	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Sviluppare una chiara comprensione della struttura e della composizione dell'amiloide è difficile per i biologi strutturali e i biochimici a causa delle complessità biologiche e delle limitazioni sperimentali nell'estrazione di fibrille purificate dai tessuti cerebrali dell'AD16,17. Le fibrille amiloidi sono polimorfiche a livello molecolare, mostrando una popolazione eterogenea di varie lunghezze e complessità18,19<sup class...

L'amiloide è una disposizione supramolecolare estremamente stabile che si trova in un gruppo diversificato di proteine, alcune delle quali portano a cambiamenti patologici1. L'accumulo di aggregati amiloidi intra- o extracellulari è osservato in diverse malattie neurodegenerative2. Gli aggregati amiloidi sono eterogenei e sono arricchiti con un gran numero di proteine e lipidi3. Negli ultimi anni, l'interesse per il proteoma amiloide ha generato un notevole interesse tra i neuroscienziati di base e traslazionali. Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre e purificare gli aggregati amiloidi dai tessuti cerebrali umani di topo e post-mortem. La microdissezione a cattura laser, l'immunoprecipitazione, la decellularizzazione e l'isolamento biochimico degli aggregati amiloidi sono metodi ampiamente utilizzati per estrarre e purificare placche amiloidi, fibrille e oligomeri 4,5,6,7. Molti di questi studi si sono concentrati sulla determinazione della composizione proteica di questi depositi fibrillari strettamente imballati utilizzando la SM semi-quantitativa. Tuttavia, i risultati disponibili sono incoerenti e il numero sorprendentemente elevato di proteine co-purificanti precedentemente riportate sono difficili da interpretare.
La limitazione principale della letteratura esistente che descrive il proteoma del nucleo amiloide nei cervelli modello murino AD e AD è che il materiale purificato contiene un numero ingestibile di proteine co-purificanti. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di superare questa limitazione e sviluppare una robusta purificazione biochimica per isolare i nuclei delle fibrille amiloidi. Questa strategia impiega un metodo biochimico basato sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità di densità del saccarosio precedentemente descritto per l'isolamento di frazioni amiloidi arricchite insolubili SDS da tessuti cerebrali umani e murini post-mortem AD 8,9. Questo metodo si basa sulla letteratura esistente, ma va oltre con l'ultrasonicazione e i lavaggi SDS per rimuovere la maggior parte delle proteine associate all'amiloide liberamente legate, portando all'isolamento di fibrille amiloidi altamente purificate (Figura 1). Le fibrille purificate da questo protocollo superano diverse sfide esistenti frequentemente incontrate negli studi strutturali delle fibrille amiloidi isolate dagli estratti cerebrali. La visualizzazione di queste fibrille con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma l'integrità e la purezza del materiale purificato (Figura 2). In questo studio, le fibrille isolate vengono solubilizzate e digerite in peptidi con tripsina e l'analisi della SM senza etichetta può facilmente rivelare l'identità delle proteine che formano il nucleo della fibrilla. In particolare, alcune di queste proteine hanno una tendenza intrinseca a formare assemblaggi supramolecolari in organelli non legati alla membrana. Inoltre, molte delle proteine identificate nell'analisi delle fibrille amiloide-beta (Aβ) sono anche associate ad altre malattie neurodegenerative, suggerendo che queste proteine possono svolgere un ruolo chiave in più proteinopatie.
È improbabile che questo metodo SDS / ultrasuoni alteri o interrompa la struttura dei nuclei delle fibrille. Il materiale purificato è adatto anche per una vasta gamma di approcci di analisi proteomica top-down e bottom-up e ulteriori strategie di analisi strutturale basate su MS, come la reticolazione chimica o lo scambio idrogeno-deuterio. Il recupero complessivo utilizzando questo metodo è relativamente elevato e, quindi, è adatto per studi strutturali dettagliati, che richiedono microgrammi a milligrammi del materiale purificato. Il materiale purificato è adatto anche per studi strutturali utilizzando crioEM e microscopia a forza atomica. Questo protocollo, in combinazione con l'etichettatura isotopica stabile dei mammiferi, può facilitare gli studi di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) della struttura amiloide10.

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		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
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biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Le inclusioni fibrillari proteiche sono caratteristiche patologiche chiave di più malattie neurodegenerative. Nelle prime fasi della malattia di Alzheimer (AD), i peptidi amiloide-beta formano protofibrille nello spazio extracellulare, che agiscono come semi che gradualmente crescono e maturano in grandi placche amiloidi. Nonostante questa comprensione di base, l'attuale conoscenza della struttura, della composizione e dei modelli di deposizione delle fibrille amiloidi nel cervello è limitata. Uno dei principali ostacoli è stata l'incapacità di isolare fibrille amiloidi altamente purificate dagli estratti cerebrali. Gli approcci basati sulla purificazione dell'affinità e sulla microdissezione di cattura laser sono stati precedentemente utilizzati per isolare le amiloidi, ma sono limitati dalla piccola quantità di materiale che può essere recuperato. Questo nuovo e robusto protocollo descrive la purificazione biochimica dei nuclei della placca amiloide utilizzando la solubilizzazione del dodecil solfato di sodio (SDS) con ultracentrifugazione e ultrasuoni del gradiente di densità di saccarosio e produce fibrille altamente pure da pazienti CON AD e tessuti cerebrali modello AD. L'analisi proteomica bottom-up basata sulla spettrometria di massa (MS) del materiale purificato rappresenta una solida strategia per identificare quasi tutti i componenti proteici primari delle fibrille amiloidi. Precedenti studi proteomici sulle proteine nelle coronae amiloidi hanno rivelato una collezione di proteine inaspettatamente ampia e funzionalmente diversificata. In particolare, dopo aver perfezionato la strategia di purificazione, il numero di proteine co-purificanti è stato ridotto di oltre 10 volte, indicando l'elevata purezza del materiale insolubile SDS isolato. La colorazione negativa e la microscopia elettronica immuno-oro hanno permesso di confermare la purezza di questi preparati. Sono necessari ulteriori studi per comprendere gli attributi spaziali e biologici che contribuiscono alla deposizione di queste proteine in inclusioni amiloidi. Nel complesso, questa strategia analitica è ben posizionata per aumentare la comprensione della biologia amiloide.

Qui, viene riassunto un metodo dettagliato per l'isolamento e la purificazione delle fibrille amiloidi utilizzando un metodo di purificazione ultracentrifugazione con gradiente di densità di saccarosio modificato (vedere Figura 1). L'innovazione in questo metodo è l'inclusione di fasi di lavaggio ad ultrasuoni utilizzando un sistema di sonicazione a bagnomaria seguito dalla solubilizzazione SDS, che rimuove molte proteine vagamente associate dalle fibrille amiloidi che co-purificano con le...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Le placche amiloidi sono necessarie per la diagnosi della malattia di Alzheimer. Tuttavia, non sono sufficienti. Nonostante questo fatto, rimangono enigmatici in parte a causa delle sfide nel caratterizzare i loro contenuti.Il nostro protocollo è altamente efficiente nell'isolare le fibrille amiloidi ad alta purezza ed è adatto per comprendere i dettagli fini della struttura e della composizione. Conoscere il contenuto proteico delle placche amiloidi può aiutare a identificare gli obiettivi dell'intervento terapeutico che possono ritardare, interferire o prevenire il loro accumulo. Pertanto, ritardando l'insorgenza della malattia.Questo metodo è adatto per estrarre depositi proteici da tessuti cerebrali degenerati e aggregati proteici in diversi altri percorsi proteici. Inizia posizionando una regione di tessuto cerebrale appena sezionata o congelata a scatto in un tubo da due millilitri contenente da sei a otto perline di ceramica in un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato. Quindi macinare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore per mulino a 4.000 giri / min con due cicli di 30 secondi di impulso on e off.Ora aggiungi nove millilitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciata a un millilitro di omogeneizzato del tessuto cerebrale e un tubo da 15 millilitri e sigilla con strisce di film di cera da laboratorio. Per garantire una robusta solubilizzazione, mantenere il tubo in rotazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere saccarosio solido alla sospensione di estratto di tessuto ad una concentrazione finale di 1,2 moli.Mescolare bene e la centrifuga ha avuto 250.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet in due millilitri di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 saccarosio molare triturando e centrifugando a 125.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione trasferire lo strato solido bianco superiore in un tubo fresco e solubilizzare un millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato accarezzando su e giù più volte.Poiché il pellet è anche arricchito con fibrille amiloidi, scartare lo strato intermedio acquoso e combinare il pellet con lo strato superiore per una resa maggiore. Centrifugare le frazioni combinate a 8.000 x g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet in un millilitro di tampone di digestione ghiacciata e incubare a temperatura ambiente per tre ore su un vortice.Centrifugare nuovamente il campione, quindi lavare il pellet due volte in un millilitro di tampone Tris ghiacciato e centrifugare di nuovo. Dopo il secondo lavaggio, risospesere il pellet in un millilitro di tampone di solubilizzazione tubando su e giù e centrifugare rapidamente il tubo a 200.000 x g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Salvare il pellet, quindi ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a un molare aggiungendo 50 millimolari tampone Tris al surnatante.Centrifugare nuovamente il surnatante, quindi sciogliere entrambi i pellet e 100 microlitri di tampone Tris contenenti lo 0,5% di SDS. Per la purificazione dell'amiloide, solubilizzare i pellet ricchi di amiloide utilizzando onde ultrasoniche in un dispositivo di sonicazione da bagno per 20 cicli, quindi centrifugare immediatamente il materiale a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospesciare il pellet in 500 microlitri da tampone SDS Tris allo 0,5% e ripetere il lavaggio altre quattro volte, dopo la fase finale di centrifugazione, lavare il pellet in 200 microlitri di acqua ultrapura e centrifugare 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere l'eventuale detersivo rimanente.Sciogliere il pellet finale contenente fibrille amiloidi purificate in 100 microlitri di acqua ultrapura. Sciogliere i 100 microlitri purificati di fibrille amiloidi in 400 microlitri di metanolo e vortice bene. Quindi mescolare di nuovo 100 microlitri di cloroformio e vortice.Quindi, aggiungere 300 microlitri di acqua ultrapura e vortice accuratamente. Dopo la centrifugazione a 12.000 x g per due minuti a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione lo strato acquoso superiore senza disturbare lo strato di interfaccia contenente il fiocco proteico e aggiungere nuovamente lo stesso volume di metanolo. Ripetere la centrifugazione, scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet.Per la digestione, sciogliere il pellet in 50 microlitri di tampone di guanidina cloridrato e sonicare in un bagno di acqua ghiacciata. Quindi vortice accuratamente per 45 minuti a un'ora a temperatura ambiente, aggiungere 50 microlitri di soluzione tensioattiva allo 0,2% e vortice di nuovo per altri 60 minuti. Quindi, aggiungere un microlitro di TCEP da 500 millimolari e incubare per 60 minuti.Quindi aggiungere due microlitri di iodoacetammide millimolare e incubare al buio per 20 minuti. Dopo l'incubazione, spegnere la iodoacetammide con cinque microlitri di soluzione TCEP per 15 minuti. Quindi, aggiungere il volume richiesto di soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare al tubo per ridurre la concentrazione di guanidina a 1,5 moli.Inoltre, aggiungere la soluzione di tensioattivo all'1% al tubo. Quindi aggiungere la tripsina e lasciare il tubo mescolando a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere acido formico alla soluzione peptidica digerita per abbassare il pH a 2,0, quindi attivare la colonna di spin C18 aggiungendo 200 microlitri di soluzione di metanolo al 50% e ruotando a 1500 x g per due minuti a temperatura ambiente.Quindi, equilibrare i letti in resina della colonna C18 aggiungendo 200 microlitri di tampone di equilibrio e ruotando di nuovo per due minuti. Dopo l'equilibrio, caricare la soluzione peptidica acidificata sulla colonna C18 e centrifugare a 1500 x g per due minuti a temperatura ambiente. Ricaricare il flusso, ruotare la colonna ed eliminare il secondo flusso.Quindi lavare i peptidi legati alla resina C18 due volte con il tampone di lavaggio. Eluire il peptide tre volte aggiungendo 40 microlitri di tampone di eluizione e centrifugando la colonna. Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto a velocità facendo evaporare la soluzione acquosa.I pellet secchi possono essere salvati a 20 gradi Celsius per alcune settimane prima dell'analisi MS. La colorazione rosso Congo degli amiloidi purificati documenta l'arricchimento delle fibrille amiloidi rispetto alla frazione solubile SDS. La frazione solubile SDS non ha mostrato la presenza di amiloidi.La struttura delle fibrille purificate ha confermato la presenza di fibrille amiloidi quasi pure. Inoltre, l'etichettatura immunogold ha confermato la presenza di peptidi amiloide-beta-42. La colorazione con anticorpi anti-amiloide-beta-42 e antifibrilla ha mostrato una relativa abbondanza di peptidi amiloide-beta-42 nelle fibrille.Le frazioni amiloidi purificate hanno mostrato la presenza di circa 250 proteine, mentre la frazione raccolta prima dell'ultrasonicazione e del lavaggio SDS conteneva più di 2.500 proteine. I nuclei di fibrille hanno mostrato un arricchimento delle proteine associate a organelli non legati alla sirena e complessi supramolecolari. Gli amiloidi sono specie a bassa abbondanza, forse da pochi picogrammi a pochi microgrammi per milligrammi di tessuti cerebrali.Quindi devi stare molto attento mentre raccogli gli strati, i pallet o scarta il surnatante. Con lo sviluppo di questa tecnica, è ora possibile identificare con maggiore sicurezza le proteine associate ai semi amiloidi iniziali, caratterizzare la loro struttura e indirizzarle per l'intervento terapeutico. Pertanto, prevenire l'insorgenza di questa malattia mortale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l&#39;agente eziologico della malattia di Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Ricerca

Neuroscienze

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...