Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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この研究は、R.J.V.およびJ.N.S.に対するNIH助成金R01AG061865によって支援されました。著者らは、ノースウェスタン大学のヴァッサーとサヴァスの研究グループのメンバーに、思慮深い議論をしてくれたことに感謝している。また、Dr(複数可)にも心から感謝します。南カリフォルニア大学のAnsgar SeimerとRalf Langenは、彼らの重要なインプットのために。ノースウェスタン大学先端顕微鏡センターでのサンプル調製と陰性染色電子顕微鏡イメージングのファリダ・コラボワ博士に感謝します。

このプロトコルは、ヒトまたは脊椎動物の脳組織の使用を含む。すべての研究は、ノースウェスタン大学の承認された機関ガイドラインに準拠して実施されました。現在のワークフローは、APP−ノックイン(App NL−G−F/NL−G−F)マウス脳皮質および海馬脳領域抽出物11を用いて標準化されている。このプロトコルは、生後6〜9ヶ月のマウスからの脳抽出物に最適?...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. 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(168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

アミロイド構造と組成の明確な理解を発展させることは、AD脳組織から精製された線維を抽出する際の生物学的複雑さと実験上の制限のために、構造生物学者および生化学者にとって挑戦的である16,17。アミロイド線維は分子レベルで多型であり、様々な長さおよび複雑さの不均一な集団を示す18、19。そ?...

アミロイドは、タンパク質の多様なパネルに見られる非常に安定した超分子配列であり、そのうちのいくつかは病理学的変化をもたらす1。細胞内または細胞外のアミロイド凝集体の蓄積は、いくつかの神経変性疾患において観察される2。アミロイド凝集体は不均一であり、多数のタンパク質および脂質で富化されている3。近年、アミロイドプロテオームへの関心は、基礎および翻訳神経科学者の間で大きな関心を生み出している。マウスおよび死後のヒト脳組織からアミロイド凝集体を抽出および精製するために、いくつかの方法が開発されている。レーザー捕捉マイクロダイセクション、免疫沈降、脱細胞化、およびアミロイド凝集体の生化学的単離は、アミロイドプラーク、線維、およびオリゴマーを抽出および精製するために広く使用されている方法である4,5,6,7。これらの研究の多くは、半定量的MSを使用して、これらの密に充填された線維性沈着物のタンパク質組成を決定することに焦点を当てている。しかし、利用可能な結果は一貫性がなく、以前に報告された驚くほど多数の共精製タンパク質は解釈が困難です。
ADおよびADマウスモデル脳におけるアミロイドコアプロテオームを記述する既存の文献の主な制限は、精製された材料が管理不能な数の共精製タンパク質を含むことである。この方法の全体的な目標は、この制限を克服し、アミロイド線維コアを単離するための堅牢な生化学的精製を開発することです。この戦略は、死後ADヒトおよびマウス脳組織からのSDS不溶性富化アミロイド画分の単離のために、先に記載したスクロース密度勾配超遠心ベースの生化学的方法を採用する8、9。この方法は既存の文献に基づいていますが、超音波処理とSDS洗浄をさらに進めて、緩く結合したアミロイド関連タンパク質の大部分を除去し、高度に精製されたアミロイド線維の単離につながります(図1)。このプロトコールによって精製された線維は、脳抽出物から単離されたアミロイド線維の構造研究において頻繁に遭遇するいくつかの既存の課題を克服する。透過型電子顕微鏡(TEM)によるこれらのフィブリルの可視化は、精製された材料の完全性および純度を確認する(図2)。この研究では、単離されたフィブリルを可溶化し、トリプシンでペプチドに消化し、ラベルフリーMS分析により、フィブリルコアを形成するタンパク質の同一性を容易に明らかにすることができる。特に、これらのタンパク質のいくつかは、非膜結合細胞小器官において超分子集合体を形成する固有の傾向を有する。さらに、アミロイドβ(Aβ)線維の分析で同定されたタンパク質の多くは、他の神経変性疾患とも関連しており、これらのタンパク質が複数のプロテインオパチーにおいて重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。
このSDS /超音波処理方法は、フィブリルコアの構造を変更または破壊する可能性は低いです。精製された材料は、幅広いトップダウンおよびボトムアッププロテオーム分析アプローチや、化学架橋や水素 - 重水素交換などの追加のMSベースの構造解析戦略にも適しています。この方法を用いた全体的な回収率は比較的高く、したがって、精製された材料のマイクログラム〜ミリグラムを必要とする詳細な構造研究に適している。精製された材料は、クライオEMおよび原子間力顕微鏡を用いた構造研究にも適している。このプロトコールは、哺乳動物の安定同位体標識と組み合わせて、アミロイド構造10の固体核磁気共鳴(NMR)研究を促進することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

タンパク質性原線維含有物は、複数の神経変性疾患の重要な病理学的特徴である。アルツハイマー病(AD)の初期段階では、アミロイドβペプチドは細胞外空間でプロトフィブリルを形成し、徐々に成長し、大きなアミロイドプラークに成熟する種子として作用する。この基本的な理解にもかかわらず、脳内のアミロイド線維構造、組成、および沈着パターンに関する現在の知識は限られている。1つの大きな障壁は、高度に精製されたアミロイド線維を脳抽出物から単離することができないことであった。アフィニティー精製およびレーザー捕捉マイクロダイセクションベースのアプローチは、以前はアミロイドを単離するために使用されてきましたが、回収できる少量の材料によって制限されています。この新規で堅牢なプロトコルは、スクロース密度勾配超遠心および超音波によるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)可溶化を用いたアミロイドプラークコアの生化学的精製を記述し、AD患者およびADモデル脳組織から高純度の線維を生じる。精製された材料の質量分析(MS)ベースのボトムアッププロテオーム分析は、アミロイド線維のほぼすべての一次タンパク質成分を同定するための堅牢な戦略を表しています。アミロイドコロナエのタンパク質に関する以前のプロテオミクス研究は、予想外に大きく、機能的に多様なタンパク質の集合体を明らかにした。注目すべきことに、精製戦略を精緻化した後、共精製タンパク質の数は10倍以上減少し、単離されたSDS不溶性物質の高純度を示す。陰性染色および免疫金電子顕微鏡観察により、これらの調製物の純度の確認が可能となった。アミロイド封入物へのこれらのタンパク質の沈着に寄与する空間的および生物学的属性を理解するためには、さらなる研究が必要である。まとめると、この分析戦略はアミロイド生物学の理解を深めるのに良い位置にあります。

ここで、改変スクロース密度勾配超遠心精製法を用いたアミロイド線維の単離精製の詳細な方法をまとめた( 図1参照)。この方法の革新は、非常に緻密で清潔な線維と共精製するアミロイド線維から多くの緩やかに関連するタンパク質を除去するSDS可溶化が続く水浴超音波処理システムを使用した超音波ベースの洗浄のステップを含めることです。超音波処理ステップは...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

アミロイドプラークは、アルツハイマー病の診断に必要です.しかし、それだけでは不十分です。この事実にもかかわらず、彼らは部分的に彼らの内容を特徴付ける際の課題のために謎めいたままです。当社のプロトコルは、アミロイド線維を高純度で単離するのに非常に効率的であり、構造および組成の細部を理解するのに非常に適している。アミロイドプラークのタンパク質含有量を知ることは、それらの蓄積を遅らせ、妨害し、または防止する可能性のある治療介入の標的を特定するのに役立つ可能性がある。したがって、疾患発症を遅らせる。この方法は、変性した脳組織からタンパク質沈着物を抽出するのによく適しており、異なる他のタンパク質経路におけるタンパク質凝集体である。まず、解剖またはスナップ凍結したばかりの脳組織領域を、新たに調製した氷冷均質化バッファーに6〜8個のセラミックビーズを含む2ミリリットルのチューブに入れます。次いで、ビーズミルホモジナイザーを用いて、30秒間のオンおよびオフパルスの2サイクルで4,000rpmで組織を粉砕する。次に、1ミリリットルの脳組織ホモジネートと15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加え、実験室用ワックスフィルムストリップでシールします。堅牢な可溶化を確実にするために、チューブを摂氏4度で一晩回転させてください。翌日、固体スクロースを組織抽出物懸濁液に終濃度1.2モルとなるように添加する。よく混合し、遠心分離機は摂氏4度で45分間250,000 x gであった。上清を捨てた後、ペレットを粉砕して1.9モルのスクロースを含む2ミリリットルの均質化緩衝液に再懸濁し、摂氏4度で125,000 x gで45分間遠心分離する。遠心分離後、上部の白色固体層を新鮮なチューブに移し、数回上下にふれあげて1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを可溶化する。ペレットはまたアミロイド線維で富んでいるので、水性中間層を捨て、より高い収率のためにペレットを最上層と組み合わせる。結合画分を8, 000 x gで摂氏4度で20分間遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの氷冷消化バッファーに再懸濁し、ボルテックス上で室温で3時間インキュベートする。試料を再度遠心分離し、次いでペレットを1ミリリットルの氷冷トリス緩衝液中で2回洗浄し、再度遠心分離する。2回目の洗浄後、ペレットを上下にピペッティングして1ミリリットルの可溶化バッファーに再懸濁し、チューブを摂氏4度で60分間200,000 x gで素早く遠心分離します。ペレットを保存し、次いで、上清に50ミリモルのトリス緩衝液を加えてスクロース濃度を1.3モルから1モルに減少させる。上清を再び遠心分離し、次いで、0.5%SDSを含むペレットおよび100マイクロリットルのトリス緩衝液の両方を溶解する。アミロイド精製のために、浴中超音波処理装置中で超音波を使用してアミロイドが豊富なペレットを20サイクル可溶化し、次いで直ちに材料を20, 000 x gで4°Cで30分間遠心分離する。ペレットを500マイクロリットルの0.5%SDSトリス緩衝液に再懸濁し、洗浄をさらに4回繰り返し、最終遠心分離工程の後、ペレットを200マイクロリットルの超純水で洗浄し、20,000 x gを摂氏4度で30分間遠心分離して、残りの洗剤を除去した。精製アミロイド線維を含む最終ペレットを100マイクロリットルの超純水に溶解する。精製された100マイクロリットルのアミロイド線維を400マイクロリットルのメタノールおよびボルテックスウェルに溶解する。その後、100マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを再び混ぜる。次に、300マイクロリットルの超純水とボルテックスを徹底的に加えます。室温で12, 000 x gで2分間遠心分離した後、タンパク質フレークを含む界面層を乱すことなく上部の水層を注意深く除去し、同じ量のメタノールを再度加える。遠心分離を繰り返し、上清を捨て、ペレットを風乾する。消化のために、ペレットを50マイクロリットルの塩酸グアニジン緩衝液に溶解し、氷冷水浴中で超音波処理する。次いで、室温で45分〜1時間十分にボルテックスし、50マイクロリットルの0.2%界面活性剤溶液を加え、さらに60分間ボルテックスを再度ボルテックスする。次に、1マイクロリットルの500ミリモルTCEPを加え、60分間インキュベートする。次いで、2マイクロリットルの500ミリモルヨードアセトアミドを加え、暗所で20分間インキュベートする。インキュベーション後、ヨードアセトアミドを5マイクロリットルのTCEP溶液で15分間クエンチする。次に、必要量の50ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液をチューブに加え、グアニジン濃度を1.5モルに減らす。また、チューブに1%界面活性剤溶液を加える。その後、トリプシンを加え、チューブを摂氏37度で一晩混合したままにします。翌日、消化ペプチド溶液にギ酸を加えてpHを2.0に下げ、200マイクロリットルの50%メタノール溶液を加え、室温で1500 x gで2分間回転させてC18スピンカラムを活性化します。次に、200マイクロリットルの平衡化バッファーを加えてC18カラム樹脂床を平衡化し、再度2分間紡糸する。平衡化後、酸性化ペプチド溶液をC18カラムにロードし、室温で1500 x gで2分間遠心分離します。フローをリロードし、カラムを回転させて、2 番目のフロースルーを破棄します。次いで、C18樹脂に結合したペプチドを洗浄バッファーで2回洗浄する。40マイクロリットルの溶出バッファーを加え、カラムを遠心分離してペプチドを3回溶出する。水溶液を蒸発させることにより速度真空濃縮器でペプチドを乾燥させる。乾燥ペレットは、MS分析の前に数週間摂氏20度で保存することができます。精製アミロイドのコンゴレッド染色は、SDS可溶性画分と比較したアミロイド線維の濃縮を文書化する。SDS可溶性画分にはアミロイドの存在は示さなかった。精製された線維の構造は、ほぼ純粋なアミロイド線維の存在を確認した。また、イムノゴールド標識はアミロイドβ-42ペプチドの存在を確認した。抗アミロイドβ−42および抗フィブリル抗体を用いた染色は、フィブリル中のアミロイドβ−42ペプチドの相対的存在量を示した。精製アミロイド画分は約250タンパク質の存在を示したが、超音波処理およびSDS洗浄前に収集された画分は2,500以上のタンパク質を含んでいた。フィブリルコアは、非膜結合オルガネラおよび超分子複合体に関連するタンパク質の濃縮を示した。アミロイドは存在量の少ない種であり、おそらく脳組織のミリグラムあたり数ピコグラムから数マイクログラムである。したがって、層、パレットを拾うとき、または上澄み液を捨てるときは、非常に注意する必要があります。この技術の開発により、初期のアミロイド種子に関連するタンパク質をより自信を持って同定し、その構造を特徴付け、治療介入のためにそれらを標的とすることができるようになりました。したがって、この致命的な病気の発症を予防する。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

樹状フィロポディアリッチ画の精製

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...