Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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이 작업은 NIH 보조금 R01AG061865에서 R.J.V. 및 J.N.S.에 의해 지원되었습니다. 저자들은 노스 웨스턴 대학의 Vassar와 Savas 연구 그룹 구성원들에게 사려 깊은 토론에 감사드립니다. 우리는 또한 진심으로 박사 (들)에게 감사드립니다. Ansgar Seimer와 Ralf Langen은 사우스 캘리포니아 대학의 중요한 의견을 제시했습니다. 노스웨스턴 대학교 고급 현미경 센터에서 시료 준비 및 음성 염색 전자 현미경 이미징을 해주신 Farida Korabova 박사님께 감사드립니다.

이 프로토콜은 인간 또는 척추 동물 뇌 조직의 사용을 포함합니다. 모든 연구는 노스 웨스턴 대학의 승인 된 제도적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 현재의 워크플로우는 APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) 마우스 뇌 피질 및 해마 뇌 영역 추출물11을 사용하여 표준화되었습니다. 이 프로토콜은 생후 6-9 개월에 생쥐의 뇌 추출물에 최적화되어 있으며 남성과 여성 동물 모?...

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	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

아밀로이드 구조 및 구성에 대한 명확한 이해를 개발하는 것은 AD 뇌 조직16,17에서 정제 된 피브릴을 추출하는 생물학적 복잡성과 실험적 한계로 인해 구조 생물 학자 및 생화학자에게 도전적입니다. 아밀로이드 피브릴은 분자 수준에서 다형성이며, 다양한 길이와 복잡성의 이종 집단을 보여줍니다18,19. 그들?...

아밀로이드는 단백질의 다양한 패널에서 발견되는 매우 안정적인 초분자 배열이며, 그 중 일부는 병리학 적 변화를 일으 킵니다1. 세포내 또는 세포외 아밀로이드 응집체의 축적은 몇몇 신경퇴행성 질환2에서 관찰된다. 아밀로이드 응집체는 이질적이며 많은 수의 단백질 및 지질로 풍부합니다3. 최근 몇 년 동안, 아밀로이드 프로테옴에 대한 관심은 기초 및 번역 신경 과학자들 사이에서 상당한 관심을 불러 일으켰습니다. 마우스 및 사후 인간 뇌 조직에서 아밀로이드 응집체를 추출하고 정제하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 레이저-포획 미세해부, 면역침전, 탈세포화 및 아밀로이드 응집체의 생화학적 분리는 아밀로이드 플라크, 피브릴 및 올리고머 4,5,6,7을 추출하고 정제하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이러한 연구의 대부분은 반 정량적 MS를 사용하여 이러한 단단히 포장 된 피브릴라 침전물의 단백질 조성을 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 이용가능한 결과는 일관성이 없으며, 이전에 보고된 놀랍게도 많은 수의 공동-정제 단백질들은 해석하기 어렵다.
AD 및 AD 마우스 모델 뇌에서 아밀로이드 코어 프로테옴을 기술하는 기존 문헌의 주요 한계는 정제된 물질이 관리불가능한 수의 공동정제 단백질을 함유한다는 것이다. 이 방법의 전반적인 목표는 이러한 한계를 극복하고 아밀로이드 피브릴 코어를 분리하기위한 강력한 생화학 적 정제를 개발하는 것입니다. 이 전략은 사후 AD 인간 및 마우스 뇌 조직으로부터 SDS 불용성 농축 아밀로이드 분획을 단리하기 위해 이전에 기술된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 기반 생화학적 방법을 이용한다(8,9). 이 방법은 기존 문헌을 기반으로하지만 초음파 처리 및 SDS 세척을 통해 느슨하게 결합 된 아밀로이드 관련 단백질의 대부분을 제거하여 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리합니다 (그림 1). 이 프로토콜에 의해 정제 된 피브릴은 뇌 추출물에서 분리 된 아밀로이드 피브릴의 구조 연구에서 자주 발생하는 몇 가지 기존 문제를 극복합니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 이러한 피브릴의 시각화는 정제 된 물질의 무결성과 순도를 확인합니다 (그림 2). 이 연구에서, 분리된 피브릴은 트립신을 갖는 펩티드로 가용화되고 소화되고, 표지가 없는 MS 분석은 피브릴 코어를 형성하는 단백질의 동일성을 용이하게 밝힐 수 있다. 특히, 이들 단백질 중 일부는 비막 결합 소기관에서 초분자 어셈블리를 형성하는 고유 한 경향을 가지고 있습니다. 또한, 아밀로이드 베타 (Aβ) 피브릴의 분석에서 확인 된 많은 단백질은 다른 신경 퇴행성 질환과도 관련이 있으며, 이는 이러한 단백질이 다중 단백질 병증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
이 SDS / 초음파 처리 방법은 피브릴 코어의 구조를 변경하거나 방해하지 않을 것입니다. 정제된 물질은 또한 광범위한 하향식 및 상향식 프로테오믹 분석 접근법 및 추가적인 MS 기반 구조 분석 전략, 예컨대 화학적 가교결합 또는 수소-중수소 교환에 적합하다. 이 방법을 사용하는 전체 회수율은 상대적으로 높기 때문에 정제 된 물질의 마이크로 그램 ~ 밀리그램이 필요한 상세한 구조 연구에 적합합니다. 정제된 물질은 또한 cryoEM 및 원자력 현미경을 이용한 구조 연구에 적합하다. 이 프로토콜은, 포유동물의 안정한 동위원소 표지와 조합하여, 아밀로이드 구조(10)의 고체 핵 자기 공명(NMR) 연구를 촉진할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
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biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

단백질성 섬유소 내포물은 다수의 신경 퇴행성 질환의 주요 병리학적 특징이다. 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 아밀로이드 베타 펩티드는 세포외 공간에서 프로토 피브릴을 형성하며, 이는 점차 성장하고 큰 아밀로이드 플라크로 성숙하는 씨앗 역할을합니다. 이러한 기본적인 이해에도 불구하고, 뇌의 아밀로이드 피브릴 구조, 조성 및 증착 패턴에 대한 현재의 지식은 제한적입니다. 한 가지 주요 장벽은 뇌 추출물에서 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리 할 수 없다는 것입니다. 친화성 정제 및 레이저 포획 미세해부-기반 접근법은 이전에 아밀로이드를 분리하기 위해 사용되어 왔지만 회수될 수 있는 소량의 물질에 의해 제한된다. 이 새롭고 강력한 프로토콜은 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 및 초음파처리를 통한 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 가용화를 사용하여 아밀로이드 플라크 코어의 생화학 적 정제를 설명하고 AD 환자 및 AD 모델 뇌 조직으로부터 고순도 피브릴을 산출합니다. 질량 분광법 (MS)-기반 정제된 물질의 상향식 프로테오믹 분석은 아밀로이드 피브릴의 거의 모든 일차 단백질 성분을 확인하기 위한 강력한 전략을 나타낸다. 아밀로이드 코로나에서 단백질에 대한 이전의 프로테오믹 연구는 예기치 않게 크고 기능적으로 다양한 단백질 모음을 밝혀 냈습니다. 주목할 만하게, 정제 전략을 정제한 후, 공동정제 단백질의 수가 10배 이상 감소하였고, 이는 단리된 SDS 불용성 물질의 고순도를 나타낸다. 음성 염색 및 면역-금 전자 현미경 검사는 이들 제제의 순도의 확인을 허용하였다. 이들 단백질을 아밀로이드 내포물로의 침착에 기여하는 공간적, 생물학적 특성을 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 종합하면,이 분석 전략은 아밀로이드 생물학에 대한 이해를 높이기 위해 좋은 위치에 있습니다.

여기서, 변형된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 정제 방법을 이용한 아밀로이드 피브릴의 분리 및 정제를 위한 상세한 방법이 요약되어 있다( 도 1 참조). 이 방법의 혁신은 수조 초음파 처리 시스템을 사용한 초음파 처리 기반 세척 단계와 SDS 가용화 단계를 포함하는 것이며, 이는 고밀도의 깨끗한 피브릴과 공동 정제하는 아밀로이드 피브릴에서 느슨하게 관련된 많은 단?...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

아밀로이드 플라크는 알츠하이머 병의 진단에 필요합니다. 그러나 그들은 충분하지 않습니다. 이 사실에도 불구하고, 그들은 부분적으로 그들의 내용을 특성화하는 데 어려움을 겪기 때문에 수수께끼로 남아 있습니다.우리의 프로토콜은 고순도에서 아밀로이드 피브릴을 분리하는 데 매우 효율적이며 구조 및 구성의 미세한 세부 사항을 이해하는 데 매우 적합합니다. 아밀로이드 플라크의 단백질 함량을 알면 축적을 지연, 간섭 또는 예방할 수있는 치료 개입의 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 질병 발병을 지연시킵니다.이 방법은 퇴화 된 뇌 조직 및 다른 단백질 경로의 단백질 응집체에서 단백질 침전물을 추출하는 데 매우 적합합니다. 갓 해부되거나 스냅 냉동 된 뇌 조직 영역을 갓 준비된 얼음 냉간 균질화 버퍼에 여섯 ~ 여덟 개의 세라믹 비드가 들어있는 두 밀리리터 튜브에 배치하여 시작하십시오. 그 후 비드 밀 호모게나이저를 이용하여 4, 000 rpm에서 30초 온 및 오프 펄스의 두 사이클로 조직을 분쇄한다.이제 9 밀리리터의 얼음 차가운 균질화 버퍼를 1 밀리리터의 뇌 조직 균질 물과 15 밀리리터 튜브에 추가하고 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉하십시오. 견고한 가용화를 보장하려면 튜브를 섭씨 네 도에서 밤새 회전시키십시오. 다음날, 고체 수크로스를 조직 추출물 현탁액에 첨가하여 1.2 몰의 최종 농도로 한다.잘 섞고 원심분리기는 섭씨 4도에서 45분 동안 250, 000 x g를 가졌다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 섭씨 4도에서 45분 동안 125, 000 x g에서 분쇄하고 원심분리하여 1.9몰 수크로스를 함유하는 균질화 완충액 2밀리리터에 재현탁시킨다. 원심분리 후 상단 백색 고체층을 신선한 튜브로 옮기고 얼음 냉간 세척 완충액 한 밀리리터를 가용화하여 여러 번 위아래로 펫팅합니다.펠릿은 또한 아밀로이드 피브릴로 풍부하기 때문에, 수성 중간층을 버리고 펠릿을 더 높은 수율을 위해 최상층과 결합시킨다. 합한 분획을 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000 x g에서 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 얼음 냉 소화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 볼텍스 상에서 세 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다.샘플을 다시 원심분리하고, 펠렛을 얼음 차가운 트리스 완충액 한 밀리리터에서 두 번 세척한 다음, 다시 원심분리한다. 두 번째 세척 후, 펠렛을 상하로 피펫팅하여 가용화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 섭씨 4도에서 60분 동안 200, 000 x g에서 튜브를 신속하게 원심분리한다. 펠렛을 저장하고, 이어서 상청액에 50 밀리몰 트리스 완충액을 첨가함으로써 수크로오스 농도를 1.3 몰에서 1몰로 감소시킨다.상청액을 다시 원심분리한 다음, 0.5%SDS를 함유하는 펠릿 및 100 마이크로리터의 트리스 완충액을 모두 용해시킨다. 아밀로이드 정제를 위해, 20 사이클 동안 욕조 초음파 처리 장치에서 초음파를 사용하여 아밀로이드가 풍부한 펠릿을 가용화 한 다음 즉시 섭씨 4도에서 30 분 동안 20, 000 x g에서 물질을 원심분리합니다. 펠렛을 0.5%SDS Tris 완충액의 500 마이크로리터에 재현탁시키고 네 번 더 세척을 반복하고, 최종 원심분리 단계 후, 펠렛을 200 마이크로리터의 초순수로 세척하고 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리 20, 000 x g로 세척하여 남아있는 세제를 제거하였다.정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 최종 펠렛을 100 마이크로리터의 초순수에 용해시킨다. 정제된 100 마이크로리터의 아밀로이드 피브릴을 400 마이크로리터의 메탄올에 녹이고 잘 와류시킨다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 클로로포름과 와류를 다시 섞으십시오.다음으로 300 마이크로 리터의 초순수와 와류를 철저히 첨가하십시오. 실온에서 2분 동안 12, 000 x g에서 원심분리한 후, 단백질 플레이크를 함유하는 계면층을 방해하지 않고 상부 수성층을 조심스럽게 제거하고 동일한 부피의 메탄올을 다시 첨가한다. 원심분리를 반복하고, 상층액을 버리고 펠렛을 공기 건조시킨다.소화를 위해 펠렛을 50 마이크로 리터의 구아니딘 염산염 완충액에 녹이고 얼음 차가운 물 욕조에서 초음파 처리하십시오. 그런 다음 실온에서 45 분에서 한 시간 동안 완전히 와류하고 0.2 % 계면 활성제 용액 50 마이크로 리터를 넣고 다시 60 분 동안 와류하십시오. 다음으로, 500 밀리몰 TCEP의 한 마이크로리터를 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션한다.그런 다음 500 밀리몰의 요오도아세트아미드 2 마이크로리터를 첨가하고 어둠 속에서 20분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 요오도아세트아미드를 5마이크로리터의 TCEP 용액으로 15분 동안 켄칭한다. 다음으로, 필요한 부피의 50 밀리몰 암모늄 중탄산염 용액을 튜브에 첨가하여 구아니딘 농도를 1.5 몰로 줄입니다.또한 튜브에 1 % 계면 활성제 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 트립신을 넣고 튜브를 섭씨 37도에서 밤새 혼합하십시오. 다음날, 소화된 펩티드 용액에 포름산을 첨가하여 pH를 2.0으로 낮춘 다음, 200 마이크로리터의 50%메탄올 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 방사함으로써 C18 스핀 컬럼을 활성화시킨다.다음에, 200 마이크로리터의 평형화 완충액을 첨가하고, 2분 동안 다시 방사함으로써 C18 컬럼 수지 베드를 평형화시킨다. 평형화 후, 산성화된 펩티드 용액을 C18 컬럼에 로딩하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 원심분리한다. 흐름을 다시 로드하고, 열을 회전하고, 두 번째 흐름을 버립니다.그런 다음 C18 수지에 결합된 펩티드를 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 40 마이크로리터의 용출 완충액을 첨가하고 컬럼을 원심분리하여 펩티드를 세 번 에루팅한다. 펩티드를 수성 용액을 증발시킴으로써 진공 농축기에서 빠르게 건조시킨다.건조 펠릿은 MS 분석 전에 몇 주 동안 섭씨 20도에서 저장할 수 있습니다. 정제된 아밀로이드의 콩고 레드 염색은 SDS 가용성 분획과 비교하여 아밀로이드 피브릴의 농축을 문서화한다. SDS 가용성 분획은 아밀로이드의 존재를 나타내지 않았다.정제된 피브릴의 구조는 거의 순수한 아밀로이드 피브릴의 존재를 확인하였다. 또한, 면역금 표지는 아밀로이드 베타-42 펩티드의 존재를 확인하였다. 항-아밀로이드 베타-42 및 항-피브릴 항체를 사용한 염색은 피브릴에서 아밀로이드 베타-42 펩티드의 상대적 풍부함을 보여주었다.정제된 아밀로이드 분획은 대략 250개의 단백질의 존재를 보인 반면, 초음파 처리 및 SDS 세척 전에 수집된 분획은 2, 500개 이상의 단백질을 함유하였다. 피브릴 코어는 비막 결합 소기관 및 초분자 복합체와 관련된 단백질의 풍부함을 나타냈다. 아밀로이드는 낮은 풍부 종이며, 아마도 뇌 조직의 밀리그램 당 몇 피코그램에서 몇 마이크로 그램까지입니다.따라서 레이어, 팔레트를 집어 들거나 상청액을 버리는 동안 매우 조심해야합니다. 이 기술의 개발로 이제 초기 아밀로이드 종자와 관련된 단백질을 더 자신있게 식별하고 구조를 특성화하며 치료 개입을 목표로 삼을 수 있습니다. 따라서이 치명적인 질병의 발병을 예방하십시오.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

연구

신경과학

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

천연 폴리페놀 커큐민을 사용하여 뇌 조직에서 아밀로이드 플라크의 라벨링 및 이미징

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...