Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres gjennomtenkte diskusjoner. Vi takker også oppriktig Dr(s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres avgjørende innspill. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøvepreparering og negativ farging elektronmikroskopiavbildning ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Denne protokollen innebærer bruk av humant eller virveldyr hjernevev. All forskning ble utført i samsvar med de godkjente institusjonelle retningslinjene til Northwestern University. Gjeldende arbeidsflyt er standardisert ved hjelp av APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) musehjerne kortikale og hippocampal hjerneregion ekstrakter11. Denne protokollen er optimalisert for hjerneekstrakter fra mus ved 6-9 måneders alder, og den kan effektivt rense amyloider fra både mannlige og kvi...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Å utvikle en klar forståelse av amyloidstruktur og sammensetning er utfordrende for strukturbiologer og biokjemikere på grunn av de biologiske kompleksitetene og eksperimentelle begrensningene ved å trekke ut rensede fibriler fra AD-hjernevev16,17. Amyloid fibrils er polymorfiske på molekylært nivå, og viser en heterogen befolkning av varierende lengder og kompleksiteter18,19. For bedre å forstå ...

Amyloid er et ekstremt stabilt supramolecular arrangement som finnes i et mangfoldig panel av proteiner, hvorav noen fører til patologiske endringer1. Akkumuleringen av intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere nevrodegenerative sykdommer2. Amyloid aggregater er heterogene og er beriket med et stort antall proteiner og lipider3. De siste årene har interessen for amyloidproteom generert betydelig interesse blant grunnleggende og translasjonelle nevrologer. Flere metoder er utviklet for å trekke ut og rense amyloidaggregater fra mus og post-mortem humant hjernevev. Laserfangst mikrodeseksjon, immunoprecipitation, decellularisering og biokjemisk isolasjon av amyloidmengder er mye brukt metoder for å trekke ut og rense amyloidplakk, fibrils og oligomerer 4,5,6,7. Mange av disse studiene har fokusert på å bestemme proteinsammensetningen av disse tettpakkede fibrillaravsetningene ved hjelp av semi-kvantitativ MS. De tilgjengelige resultatene er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antallet co-rensende proteiner som tidligere er rapportert, er utfordrende å tolke.
Den primære begrensningen i den eksisterende litteraturen som beskriver amyloidkjerneproteomet i AD- og AD-musemodellhjerner, er at det rensede materialet inneholder et uhåndterlig antall korensende proteiner. Det overordnede målet med denne metoden er å overvinne denne begrensningen og utvikle en robust biokjemisk rensing for å isolere amyloidfibrilkjerner. Denne strategien benytter en tidligere beskrevet sukrose tetthet gradient ultracentrifugation-basert biokjemisk metode for isolering av SDS uoppløselige beriket amyloid fraksjoner fra post-mortem AD human og mus hjernevev 8,9. Denne metoden bygger på den eksisterende litteraturen, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vasker for å fjerne de fleste løst bundne amyloid-tilknyttede proteiner, noe som fører til isolering av svært rensede amyloidfibriler (figur 1). Fibrils renset av denne protokollen overvinne flere eksisterende utfordringer ofte møtt i strukturelle studier av amyloid fibrils isolert fra hjernen ekstrakter. Visualisering av disse fibrilene med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bekrefter integriteten og renheten til det rensede materialet (figur 2). I denne studien blir de isolerte fibrilene solubilisert og fordøyd til peptider med trypsin, og etikettfri MS-analyse kan lett avsløre identiteten til proteinene som danner fibrilkjernen. Spesielt har noen av disse proteinene en iboende tendens til å danne supramolekulære forsamlinger i ikke-membranbundne organeller. I tillegg er mange av proteinene identifisert i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibrils også forbundet med andre nevrodegenerative sykdommer, noe som tyder på at disse proteinene kan spille en nøkkelrolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetoden er usannsynlig å endre eller forstyrre strukturen til fibrilkjernene. Det rensede materialet er også egnet for et bredt spekter av ovenfra og ned og nedenfra-og-opp proteomiske analysetilnærminger og ytterligere MS-baserte strukturelle analysestrategier, for eksempel kjemisk krysskobling eller hydrogen-deuteriumutveksling. Den totale utvinningen ved hjelp av denne metoden er relativt høy og er derfor egnet for detaljerte strukturelle studier, som krever mikrogram til milligram av det rensede materialet. Det rensede materialet er også egnet for strukturelle studier ved hjelp av kryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokollen, i kombinasjon med stabil isotopisk merking av pattedyr, kan lette solid-state kjernemagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Proteinholdige fibrillar inneslutninger er viktige patologiske kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer. I de tidlige stadiene av Alzheimers sykdom (AD) danner amyloid-beta peptider protofibrils i det ekstracellulære rommet, som fungerer som frø som gradvis vokser og modnes til store amyloidplakk. Til tross for denne grunnleggende forståelsen er dagens kunnskap om amyloidfibrilstrukturen, sammensetningen og avsetningsmønstrene i hjernen begrenset. En stor barriere har vært manglende evne til å isolere svært rensede amyloidfibriler fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensing og laserfangst mikrodeseksjonsbaserte tilnærminger har tidligere blitt brukt til å isolere amyloider, men er begrenset av den lille mengden materiale som kan gjenvinnes. Denne nye, robuste protokollen beskriver biokjemisk rensing av amyloid plakkkjerner ved hjelp av natrium dodecylsulfat (SDS) solubilisering med sukrose tetthet gradient ultracentrifugation og ultralydbehandling og gir svært rene fibrils fra AD pasienter og AD modell hjernevev. Massespektrometri (MS)-basert bunn-opp proteomisk analyse av det rensede materialet representerer en robust strategi for å identifisere nesten alle de primære proteinkomponentene i amyloidfibriler. Tidligere proteomiske studier av proteiner i amyloid korona har avslørt en uventet stor og funksjonelt mangfoldig samling av proteiner. Spesielt, etter å ha raffinert rensestrategien, ble antall korensende proteiner redusert med mer enn 10 ganger, noe som indikerer den høye renheten til det isolerte SDS-uoppløselige materialet. Negativ farging og immuno-gull elektronmikroskopi tillot bekreftelse på renheten til disse preparatene. Videre studier er nødvendig for å forstå de romlige og biologiske egenskapene som bidrar til avsetning av disse proteinene til amyloid inneslutninger. Samlet sett er denne analytiske strategien godt posisjonert for å øke forståelsen av amyloidbiologi.

Her oppsummeres en detaljert metode for isolering og rensing av amyloidfibriler ved hjelp av en modifisert sukrosetetthetsgradient ultrasentrifugation rensingsmetode (se figur 1). Innovasjonen i denne metoden er inkludering av trinn i ultralydbehandlingsbasert vask ved hjelp av et vannbad sonikeringssystem etterfulgt av SDS-solubilisering, som fjerner mange løst tilknyttede proteiner fra amyloidfibrilene som korenser med de svært tette og rene fibrilene. Ultralydstrinnet genererer en høy ...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Denne biokjemiske rensemetoden med massespektrometribasert proteomisk analyse letter den robuste karakteriseringen av amyloidfibrilkjerner, noe som kan akselerere identifiseringen av mål for å forhindre Alzheimers sykdom.

Biokjemisk rensing og proteomisk karakterisering av Amyloid Fibril-kjerner fra hjernen

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Amyloidplakk er nødvendig for diagnostisering av Alzheimers sykdom. De er imidlertid ikke tilstrekkelige. Til tross for dette forblir de gåtefulle, delvis på grunn av utfordringer med å karakterisere innholdet.Vår protokoll er svært effektiv til å isolere amyloidfibrils med høy renhet og er godt egnet for å forstå de fine detaljene i struktur og sammensetning. Å vite proteininnholdet i amyloidplakk kan bidra til å identifisere målene for terapeutisk inngrep som kan forsinke, forstyrre eller forhindre akkumulering. Derfor forsinker sykdommen utbruddet.Denne metoden er godt egnet for å trekke ut proteinavsetninger fra degenerert hjernevev og proteinaggregater i forskjellige andre proteinveier. Begynn med å plassere en ny dissekert eller snap frossen hjernevevsregion i et to milliliterrør som inneholder seks til åtte keramiske perler i nylaget iskald homogeniseringsbuffer. Slip deretter vevet ved hjelp av en perlemølle homogenisator ved 4000 rpm med to sykluser på 30 sekunder på og av puls.Legg nå ni milliliter iskald homogeniseringsbuffer til den ene milliliteren hjernevevshomogenat og et 15 milliliter rør og tetning med laboratorievoksfilmstrimler. For å sikre robust løselighet, hold røret roterende over natten ved fire grader Celsius. Neste dag, legg til solid sukrose til vevsekstrakt suspensjon til en endelig konsentrasjon på 1,2 mol.Bland godt og sentrifuge hadde 250.000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha kastet supernatanten, resuspenderer pellet i to milliliter homogeniseringsbuffer som inneholder 1,9 molar sukrose ved å triturere og sentrifuge ved 125 000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering overfør det øverste hvite faste laget til et friskt rør og solubiliser en milliliter iskald vaskebuffer ved å klappe opp og ned flere ganger.Siden pelletsen også er beriket med amyloidfibrils, kast det vandige mellomlaget og kombiner pelletsen med topplaget for et høyere utbytte. Sentrifuger de kombinerte fraksjonene ved 8000 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha kastet supernatanten, resuspend pellet i en milliliter iskald fordøyelsesbuffer og inkuber ved romtemperatur i tre timer på en virvel.Sentrifuger prøven igjen, vask deretter pellet to ganger i en milliliter iskald Tris buffer og sentrifuger igjen. Etter den andre vasken, resuspend pellet i en milliliter av solubilisering buffer ved pipettering opp og ned og raskt sentrifugere røret ved 200,000 x g i 60 minutter ved fire grader Celsius. Lagre pellet, og reduser deretter sukrosekonsentrasjonen fra 1,3 til en molar ved å legge til 50 millimolar Tris buffer til supernatanten.Sentrifuger supernatanten igjen, og løs deretter opp både pellets og 100 mikroliter Tris-buffer som inneholder 0,5% SDS. For amyloid rensing, solubiliser de amyloidrike pelletsene ved hjelp av ultralydbølger i en bad sonikeringsenhet i 20 sykluser, og sentrifuger deretter straks materialet ved 20.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Resuspend pellet i 500 mikroliter av 0,5% SDS Tris buffer og gjenta vaskingen fire ganger, Etter det endelige sentrifugeringstrinnet, vask pellet i 200 mikroliter ultrapure vann og sentrifuger 20.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius for å fjerne eventuelt gjenværende vaskemiddel.Løs opp den endelige pelletsen som inneholder rensede amyloidfibriler i 100 mikroliter ultrarent vann. Løs opp de rensede 100 mikroliter av amyloidfibriler i 400 mikroliter metanol og virvelbrønn. Bland deretter inn 100 mikroliter kloroform og virvel igjen.Deretter tilsettes 300 mikroliter ultrarent vann og virvel grundig. Etter sentrifugering ved 12.000 x g i to minutter ved romtemperatur, fjern forsiktig det øverste vandige laget uten å forstyrre grensesnittlaget som inneholder proteinflaket og tilsett samme volum metanol igjen. Gjenta sentrifugeringen, kast supernatanten og lufttørk pelletsen.For fordøyelsen, oppløs pellet i 50 mikroliter guanidinhydrokloridbuffer og soniker i et iskaldt vannbad. Deretter virvel grundig i 45 minutter til en time ved romtemperatur, tilsett 50 mikroliter 0,2% overflateaktiv løsning og virvel igjen i ytterligere 60 minutter. Deretter legger du til en mikroliter på 500 millimolar TCEP og inkuberer i 60 minutter.Tilsett deretter to mikroliter på 500 millimolar iodoacetamid og inkuber i mørket i 20 minutter. Etter inkubasjonen slukker du iodoacetamidet med fem mikroliter TCEP-oppløsning i 15 minutter. Deretter legger du til det nødvendige volumet på 50 millimolar ammoniumbikarbonatoppløsning til røret for å redusere guanidinkonsentrasjonen til 1,5 mol.Legg også til 1% overflateaktiv løsning på røret. Tilsett deretter trypsin og la røret blandes ved 37 grader Celsius over natten. Neste dag, tilsett maursyre til den fordøyde peptidløsningen for å senke pH til 2,0, aktiver deretter C18-spinnkolonnen ved å legge til 200 mikroliter 50% metanoloppløsning og spinne ved 1500 x g i to minutter ved romtemperatur.Deretter likevekter C18-kolonneharpikssenger ved å legge til 200 mikroliter likevektsbuffer og spinne igjen i to minutter. Etter likevekt, last den surgjorte peptidløsningen på C18-kolonnen og sentrifugen ved 1500 x g i to minutter ved romtemperatur. Last inn gjennomstrømningen på nytt, snurr kolonnen og kast den andre gjennomstrømningen.Vask deretter peptidene som er bundet til C18-harpiksen to ganger med vaskebufferen. Elute peptid tre ganger ved å legge til 40 mikroliter elution buffer og sentrifugerer kolonnen. Tørk peptidene i en hastighetsvakuumkonsentrator ved å fordampe den vandige løsningen.De tørre pelletsene kan lagres ved 20 grader Celsius i noen uker før MS-analysen. Kongo rød farging av rensede amyloider dokumenterer berikelsen av amyloidfibrilene sammenlignet med SDS løselig brøkdel. SDS løselig brøkdel viste ikke tilstedeværelsen av amyloider.Strukturen av de rensede fibrilene bekreftet tilstedeværelsen av nesten rene amyloidfibriler. Også immunogold merking bekreftet tilstedeværelsen av amyloid beta-42 peptider. Farging ved bruk av anti-amyloid beta-42 og anti-fibril antistoffer viste en relativ overflod av amyloid beta-42 peptider i fibrils.Rensede amyloidfraksjoner viste tilstedeværelsen av ca. 250 proteiner, mens fraksjonen samlet før ultralydbehandling og SDS-vask inneholdt mer enn 2500 proteiner. Fibril-kjerner viste berikelse av proteiner forbundet med ikke-bundne organeller og supramolekulære komplekser. Amyloider er lave overflodsarter, kanskje noen få piktogrammer til få mikrogram per milligram hjernevev.Så du må være veldig forsiktig mens du plukker opp lagene, pallene eller kaster supernatanten. Med utviklingen av denne teknikken kan du nå mer trygt identifisere proteiner forbundet med de første amyloidfrøene, karakterisere strukturen og målrette dem mot terapeutisk inngrep. Derfor forhindrer utbruddet av denne dødelige sykdommen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk Karakterisering av Brain-implantert Microdevices og omkringliggende vev

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolasjon og kultur av endotelceller fra Embryonale brain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaksisk Infusjon av Oligomeric amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 giftighet og Neurodegeneration i voksen sebrafisk hjernen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisering av Amyloid β i den menneskelige hjernen med Matrix-assistert Laser desorpsjon/ionisering Imaging massespektrometri

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Merking og Imaging av amyloid plaketter i Brain tissue bruke Natural polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...