Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Os autores agradecem a Vassar e aos membros do grupo de pesquisa Savas na Universidade Northwestern por suas discussões pensativas. Também agradecemos sinceramente ao Dr.s. Ansgar Seimer e Ralf Langen na Universidade do Sul da Califórnia por sua contribuição crucial. Agradecemos ao Dr. Farida Korabova pela preparação da amostra e imagens de microscopia eletrônica de coloração negativa no Centro de Microscopia Avançada da Universidade northwestern.

Este protocolo envolve o uso de tecidos cerebrais humanos ou vertebrados. Toda a pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais aprovadas da Universidade northwestern. O fluxo de trabalho atual é padronizado usando o cérebro do cérebro do cérebro do rato (AppNL-G-F/NL-G-F) extrai11. Este protocolo foi otimizado para extratos cerebrais de camundongos aos 6-9 meses de idade, e pode efetivamente purificar amiloides de animais machos e fêmeas.
<p c...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Desenvolver uma compreensão clara da estrutura e composição amiloide é um desafio para biólogos e bioquímicos estruturais devido às complexidades biológicas e limitações experimentais na extração de fibrilas purificadas dos tecidos cerebrais da AD16,17. Fibrilas amiloides são polimórficas a nível molecular, mostrando uma população heterogênea de comprimentos e complexidades variados18,19...

Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas1. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas2. Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios3. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos cerebrais humanos de camundongos e pós-morte. Microdisseção de captura a laser, imunoprecipitação, descelularização e isolamento bioquímico de agregados amiloides são métodos amplamente utilizados para extrair e purificar placas amiloides, fibrilas e oligômeros 4,5,6,7. Muitos desses estudos têm se concentrado em determinar a composição proteica desses depósitos fibrilares bem embalados usando em ms semi-quantitativo. No entanto, os resultados disponíveis são inconsistentes, e o número surpreendentemente grande de proteínas co-purificadoras relatadas anteriormente são desafiadores de interpretar.
A principal limitação da literatura existente descrevendo o núcleo amiloide nos cérebros modelo de camundongos AD e AD é que o material purificado contém um número incontrolável de proteínas co-purificadoras. O objetivo global deste método é superar essa limitação e desenvolver uma purificação bioquímica robusta para isolar núcleos de fibrila amiloide. Esta estratégia emprega um método bioquímico baseado em afluente de densidade de sacarose anteriormente descrito para o isolamento de frações amiloides enriquecidas insolúveis da SDS a partir de tecidos cerebrais humanos e camundongos pós-morte 8,9. Este método baseia-se na literatura existente, mas vai além com a ultrassonização e as lavagens SDS para remover a maioria das proteínas amiloides frouxamente ligadas, levando ao isolamento de fibrilas amiloides altamente purificadas (Figura 1). As fibrilas purificadas por este protocolo superam vários desafios existentes frequentemente encontrados em estudos estruturais de fibrilas amiloides isolados de extratos cerebrais. A visualização dessas fibrilas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma a integridade e pureza do material purificado (Figura 2). Neste estudo, as fibrilas isoladas são solubilizadas e digeridas em peptídeos com trippsina, e a análise de MS sem rótulos pode facilmente revelar a identidade das proteínas que formam o núcleo fibril. Notavelmente, algumas dessas proteínas têm uma tendência inerente à formação de conjuntos supramoleculares em organelas não ligadas à membrana. Além disso, muitas das proteínas identificadas na análise de fibrilas amilóide-beta (Aβ) também estão associadas a outras doenças neurodegenerativas, sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel fundamental em múltiplas proteinopatias.
Este método SDS/ultrasonicação é improvável de alterar ou interromper a estrutura dos núcleos fibril. O material purificado também é adequado para uma ampla gama de abordagens de análise proteômica de cima para baixo e de baixo para cima e estratégias adicionais de análise estrutural baseada em MS, como crosslinking químico ou troca de deutério de hidrogênio. A recuperação geral usando este método é relativamente alta e, portanto, é adequada para estudos estruturais detalhados, que requerem microgramas a miligramas do material purificado. O material purificado também é adequado para estudos estruturais utilizando crioEM e microscopia de força atômica. Este protocolo, em combinação com a rotulagem isotópica estável de mamíferos, pode facilitar estudos de ressonância magnética nuclear de estado sólido (RMN) da estrutura amiloide10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

As inclusões fibrilares proteináceas são marcas patológicas fundamentais de múltiplas doenças neurodegenerativas. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA), peptídeos amilóide-beta formam protofibrilas no espaço extracelular, que agem como sementes que gradualmente crescem e amadurecem em grandes placas amiloides. Apesar dessa compreensão básica, o conhecimento atual da estrutura de fibrila amiloide, composição e padrões de deposição no cérebro é limitado. Uma grande barreira tem sido a incapacidade de isolar fibrilas amiloides altamente purificadas de extratos cerebrais. A purificação de afinidade e as abordagens baseadas em microdissecção de captura a laser foram usadas anteriormente para isolar amiloides, mas são limitadas pela pequena quantidade de material que pode ser recuperada. Este novo protocolo robusto descreve a purificação bioquímica de núcleos de placas amiloides usando solubilização de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) com ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose e ultrassônicas e produz fibrilas altamente puras de pacientes com DA e tecidos cerebrais modelo AD. A análise proteômica de baixo para cima baseada em espectrometria de massa (MS) do material purificado representa uma estratégia robusta para identificar quase todos os componentes proteicos primários das fibrilas amiloides. Estudos proteômicos anteriores de proteínas na coronária amiloide revelaram uma coleção inesperadamente grande e funcionalmente diversificada de proteínas. Notavelmente, após o refino da estratégia de purificação, o número de proteínas de co-purificação foi reduzido em mais de 10 vezes, indicando a alta pureza do material isolado SDS insolúvel. A coloração negativa e a microscopia eletrônica imuno-ouro permitiram a confirmação da pureza dessas preparações. Outros estudos são necessários para compreender os atributos espaciais e biológicos que contribuem para a deposição dessas proteínas em inclusões amiloides. Em conjunto, essa estratégia analítica está bem posicionada para aumentar a compreensão da biologia amiloide.

Aqui, um método detalhado para o isolamento e purificação de fibrilas amiloides usando um método de purificação de ultracentrifugação de densidade de sacarose modificada é resumido (ver Figura 1). A inovação neste método é a inclusão de etapas de lavagem à base de ultrassonificação utilizando um sistema de sônica de banho de água seguido pela solubilização do SDS, que remove muitas proteínas vagamente associadas das fibrilas amiloides que co-purificam com as fibrilas al...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Placas amiloides são necessárias para o diagnóstico da doença de Alzheimer. No entanto, eles não são suficientes. Apesar disso, permanecem enigmáticos devido, em parte, a desafios na caracterização de seus conteúdos.Nosso protocolo é altamente eficiente em isolar fibrilas amiloides em alta pureza e é adequado para entender os detalhes finos da estrutura e da composição. Conhecer o teor proteico das placas amiloides pode ajudar a identificar os alvos de intervenção terapêutica que podem retardar, interferir ou prevenir seu acúmulo. Portanto, atrasando o início da doença.Este método é bem adequado para extrair depósitos de proteínas de tecidos cerebrais degenerados e agregados de proteínas em diferentes outras vias proteicas. Comece colocando uma região de tecido cerebral congelado recém-dissecada ou escamosa em um tubo de dois mililitros contendo seis a oito contas de cerâmica em um tampão de homogeneização fria recém-preparada. Em seguida, triture o tecido usando um homogeneizador de moinho de contas a 4.000 rpm com dois ciclos de 30 segundos dentro e fora do pulso.Agora adicione nove mililitros de tampão de homogeneização fria ao um mililitro de homogeneização do tecido cerebral e um tubo de 15 mililitros e selo com tiras de filme de cera de laboratório. Para garantir a solubilização robusta, mantenha o tubo girando durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, adicione sacarose sólida à suspensão do extrato de tecido a uma concentração final de 1,2 mols.Misture bem e centrífuga teve 250.000 x g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernascimento, resuspenque a pelota em dois mililitros de tampão de homogeneização contendo 1,9 sacarose molar por trituração e centrífuga a 125.000 x g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação transfira a camada sólida branca superior para um tubo fresco e solubilize um mililitro de tampão de lavagem gelada acariciando-se várias vezes.Uma vez que a pelota também é enriquecida com fibrilas amiloides, descarte a camada média aquosa e combine a pelota com a camada superior para um rendimento maior. Centrifugar as frações combinadas a 8.000 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernascimento, resuspenque a pelota em um mililitro de tampão de digestão gelada e incubar à temperatura ambiente por três horas em um vórtice.Centrifugar a amostra novamente, em seguida, lavar a pelota duas vezes em um mililitro de tampão tris frio gelado e centrífuga novamente. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de solubilização por pipetar para cima e para baixo e centrifugar rapidamente o tubo a 200.000 x g por 60 minutos a quatro graus Celsius. Salve a pelota, depois reduza a concentração de sacarose de 1,3 para um molar adicionando 50 mililitros de tampão Tris ao supernatante.Centrifugar o supernante novamente, em seguida, dissolver as duas pelotas e 100 microliters de tampão Tris contendo 0,5% SDS. Para purificação amiloide, solubilize as pelotas ricas em amiloides usando ondas de ultrassom em um dispositivo de sônica de banho por 20 ciclos, depois centrifugar imediatamente o material a 20.000 x g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenque a pelota em 500 microlitres de tampão SDS Tris de 0,5% e repita a lavagem mais quatro vezes, Após a etapa final de centrifugação, lave a pelota em 200 microlitradores de água ultrauso e centrífugue 20.000 x g por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover qualquer detergente restante.Dissolva a última pelota contendo fibrilas amiloides purificadas em 100 microliters de água ultrapura. Dissolva os 100 microliters purificados de fibrilas amiloides em 400 microliters de metanol e vórtice bem. Em seguida, misture em 100 microliters de clorofórmio e vórtice novamente.Em seguida, adicione 300 microliters de água ultrapura e vórtice completamente. Após a centrifugação a 12.000 x g por dois minutos em temperatura ambiente, remova cuidadosamente a camada superior aquosa sem perturbar a camada de interface contendo o floco de proteína e adicione novamente o mesmo volume de metanol. Repita a centrifugação, descarte o sobrenasce e seque a pelota.Para digestão, dissolva a pelota em 50 microliters de tampão de cloridrato de guanidina e sonicato em um banho de água gelada. Em seguida, o vórtice completamente por 45 minutos a uma hora em temperatura ambiente, adicione 50 microliters de solução surfactante de 0,2% e vórtice novamente por mais 60 minutos. Em seguida, adicione um microliter de 500 milmolares DE TCEP e incubar por 60 minutos.Em seguida, adicione dois microliters de iodoacetamida de 500 milimolares e incubar no escuro por 20 minutos. Após a incubação, sacie a iodoacetamida com cinco microliters de solução TCEP por 15 minutos. Em seguida, adicione o volume necessário de 50 milimônios solução de bicarbonato de amônio ao tubo para reduzir a concentração de guanidina para 1,5 mols.Além disso, adicione 1% de solução surfactante ao tubo. Em seguida, adicione trippsina e deixe o tubo se misturando a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione ácido fórmico à solução de peptídeo digerido para baixar o pH para 2.0, em seguida, ative a coluna de giro C18 adicionando 200 microliters de solução de 50% metanol e girando a 1500 x g por dois minutos à temperatura ambiente.Em seguida, equilibre os leitos de resina da coluna C18 adicionando 200 microliters de tampão de equilíbrio e girando novamente por dois minutos. Após o equilíbrio, carregue a solução de peptídeo acidificado na coluna C18 e centrífuga a 1500 x g por dois minutos à temperatura ambiente. Recarregue o fluxo através, gire a coluna e descarte o segundo fluxo através.Em seguida, lave os peptídeos ligados à resina C18 duas vezes com o tampão de lavagem. Elute o peptídeo três vezes adicionando 40 microliters de tampão de eluição e centrifugando a coluna. Seque os peptídeos em um concentrador de vácuo de velocidade evaporando a solução aquosa.As pelotas secas podem ser salvas a 20 graus Celsius por algumas semanas antes da análise de MS. A coloração vermelha do Congo de amiloides purificados documenta o enriquecimento das fibrilas amiloides em comparação com a fração solúvel da SDS. A fração solúvel da SDS não mostrou a presença de amiloides.A estrutura das fibrilas purificadas confirmou a presença de fibrilas amiloides quase puras. Além disso, a rotulagem de imunogold confirmou a presença de peptídeos beta-42 amiloides. As manchas usando anticorpos beta-42 anti-amilóides e anti-fibril mostraram uma abundância relativa de peptídeos beta-42 amiloides em fibrilas.Frações amiloides purificadas mostraram a presença de aproximadamente 250 proteínas, enquanto a fração coletada antes da ultrassônica e lavagem de SDS continha mais de 2.500 proteínas. Os núcleos fibril apresentaram enriquecimento de proteínas associadas a organelas e complexos supramoleculares não ligados à memmbrana. Amiloides são espécies de baixa abundância, talvez alguns picogramas a poucos microgramas por miligramas de tecidos cerebrais.Então você precisa ter muito cuidado ao pegar as camadas, paletes ou descartar o supernatante. Com o desenvolvimento dessa técnica, agora você pode identificar com mais confiança proteínas associadas às sementes amiloides iniciais, caracterizar sua estrutura e direcioná-las para intervenção terapêutica. Portanto, prevenindo o aparecimento desta doença mortal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Neurociência

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...