Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH R01AG061865 R.J.V. и J.N.S. Авторы благодарят членов исследовательской группы Вассара и Саваса в Северо-Западном университете за их вдумчивые дискуссии. Мы также искренне благодарим д-ра(ов). Ансгар Займер и Ральф Ланген из Университета Южной Калифорнии за их важный вклад. Мы благодарим доктора Фариду Корабову за подготовку образцов и электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием в Центре передовой микроскопии Северо-Западного университета.

Этот протокол предполагает использование тканей мозга человека или позвоночных. Все исследования проводились в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами Северо-Западного университета. Текущий рабочий процесс стандартизирован с использованием APP-knock in...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Разработка четкого понимания структуры и состава амилоида является сложной задачей для структурных биологов и биохимиков из-за биологических сложностей и экспериментальных ограничений в извлечении очищенных фибрилл из тканей мозга AD16,17. Амилоидные фи...

Амилоид является чрезвычайно стабильным супрамолекулярным расположением, которое содержится в разнообразной панели белков, некоторые из которых приводят к патологическим изменениям1. Накопление внутри- или внеклеточных амилоидных агрегатов наблюдается при нескольких нейродегенеративных заболеваниях2. Амилоидные агрегаты неоднородны и обогащены большим количеством белков и липидов3. В последние годы интерес к амилоидному протеому вызвал значительный интерес среди базовых и трансляционных нейробиологов. Было разработано несколько методов извлечения и очистки амилоидных агрегатов из тканей мозга мыши и посмертного вскрытия человека. Микродиссекция лазерного захвата, иммунопреципитация, децеллюляризация и биохимическая изоляция амилоидных агрегатов являются широко используемыми методами извлечения и очистки амилоидных бляшек, фибрилл и олигомеров 4,5,6,7. Многие из этих исследований были сосредоточены на определении белкового состава этих плотно упакованных фибриллярных отложений с использованием полуколичественного РС. Тем не менее, имеющиеся результаты противоречивы, и удивительно большое количество совместно очищающих белков, о которых сообщалось ранее, трудно интерпретировать.
Основным ограничением существующей литературы, описывающей протеом амилоидного ядра в мозге мышиных моделей AD и AD, является то, что очищенный материал содержит неуправляемое количество совместно очищающих белков. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы преодолеть это ограничение и разработать надежную биохимическую очистку для выделения амилоидных фибрильных кернов. Эта стратегия использует ранее описанный биохимический метод ультрацентрифугирования на основе ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы для выделения нерастворимых амилоидных фракций SDS из посмертных тканей мозга человека и мыши 8,9. Этот метод основан на существующей литературе, но идет дальше с ультразвуком и промывкой SDS для удаления большинства слабо связанных амилоид-ассоциированных белков, что приводит к выделению высокоочищенных амилоидных фибрилл (рисунок 1). Фибриллы, очищенные этим протоколом, преодолевают несколько существующих проблем, часто встречающихся в структурных исследованиях амилоидных фибрилл, выделенных из экстрактов мозга. Визуализация этих фибрилл с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) подтверждает целостность и чистоту очищенного материала (рисунок 2). В этом исследовании изолированные фибриллы солюбилизируются и перевариваются до пептидов с трипсином, а анализ РС без меток может легко выявить идентичность белков, образующих ядро фибрилл. Примечательно, что некоторые из этих белков имеют врожденную тенденцию к образованию супрамолекулярных сборок в немембранных органеллах. Кроме того, многие из белков, идентифицированных при анализе бета-амилоидных (Aβ) фибрилл, также связаны с другими нейродегенеративными заболеваниями, предполагая, что эти белки могут играть ключевую роль в множественных протеинопатиях.
Этот метод SDS/ультразвука вряд ли изменит или нарушит структуру фибрилловых сердечников. Очищенный материал также подходит для широкого спектра подходов к протеомному анализу сверху вниз и снизу вверх и дополнительных стратегий структурного анализа на основе MS, таких как химическое сшивание или водородно-дейтериевый обмен. Общее восстановление с использованием этого метода относительно высокое и, таким образом, подходит для подробных структурных исследований, которые требуют от микрограммов до миллиграммов очищенного материала. Очищенный материал также подходит для структурных исследований с использованием криоЭМ и атомно-силовой микроскопии. Этот протокол в сочетании со стабильной изотопной маркировкой млекопитающих может облегчить исследования твердотельного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) амилоидной структуры10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Белковые фибриллярные включения являются ключевыми патологическими признаками множественных нейродегенеративных заболеваний. На ранних стадиях болезни Альцгеймера (БА) бета-амилоидные пептиды образуют протофибриллы во внеклеточном пространстве, которые действуют как семена, которые постепенно растут и созревают в большие амилоидные бляшки. Несмотря на это базовое понимание, современные знания о структуре, составе и моделях осаждения амилоидных фибрилов в мозге ограничены. Одним из основных препятствий была неспособность выделить высокоочищенные амилоидные фибриллы из экстрактов мозга. Подходы на основе аффинной очистки и лазерного захвата на основе микродиссекции ранее использовались для выделения амилоидов, но ограничены небольшим количеством материала, который может быть восстановлен. Этот новый, надежный протокол описывает биохимическую очистку ядер амилоидных бляшек с использованием солюбилизации додецилсульфата натрия (SDS) с ультрацентрифугированием и ультразвуком градиента плотности сахарозы и дает высокочистые фибриллы от пациентов с БА и тканей мозга модели АД. Протеомный анализ очищенного материала на основе масс-спектрометрии (MS) представляет собой надежную стратегию идентификации почти всех первичных белковых компонентов амилоидных фибрилл. Предыдущие протеомные исследования белков в амилоидной короне выявили неожиданно большую и функционально разнообразную коллекцию белков. Примечательно, что после уточнения стратегии очистки количество белков совместной очистки сократилось более чем в 10 раз, что указывает на высокую чистоту изолированного нерастворимого материала SDS. Отрицательное окрашивание и иммунозолотая электронная микроскопия позволили подтвердить чистоту этих препаратов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять пространственные и биологические атрибуты, которые способствуют отложению этих белков в амилоидные включения. Взятые вместе, эта аналитическая стратегия имеет хорошие возможности для повышения понимания биологии амилоида.

Здесь обобщен подробный способ выделения и очистки амилоидных фибрилл с использованием модифицированного метода ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы (см. фиг.1). Инновацией в этом методе является включение этапов стирки на ...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Этот метод биохимической очистки с протеомным анализом на основе масс-спектрометрии облегчает надежную характеристику амилоидных фибровых ядер, что может ускорить идентификацию мишеней для профилактики болезни Альцгеймера.

Биохимическая очистка и протеомная характеристика амилоидных ядер Фибриля из головного мозга

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Амилоидные бляшки необходимы для диагностики болезни Альцгеймера. Однако их недостаточно. Несмотря на этот факт, они остаются загадочными отчасти из-за проблем в характеристике их содержания.Наш протокол очень эффективен при выделении амилоидных фибрилл высокой чистоты и хорошо подходит для понимания мелких деталей структуры и состава. Знание содержания белка в амилоидных бляшках может помочь определить цели терапевтического вмешательства, которые могут задерживать, мешать или предотвращать их накопление. Поэтому затягивается начало заболевания.Этот метод хорошо подходит для извлечения белковых отложений из дегенерированных тканей мозга и белковых агрегатов в различных других белковых путях. Начните с помещения свежерассеченной или замороженной области мозговой ткани в двухмиллилитровую трубку, содержащую шесть-восемь керамических шариков, в свежеприготовленный буфер гомогенизации ледяного холода. Затем измельчите ткань с помощью гомогенизатора шариковой мельницы со скоростью 4 000 оборотов в минуту с двумя циклами по 30 секунд включения и выключения импульса.Теперь добавьте девять миллилитров буфера гомогенизации ледяного холода к одному миллилитру гомогената мозговой ткани и 15-миллилитровой трубке и запечатайте полосками лабораторной восковой пленки. Чтобы обеспечить надежную солюбилизацию, держите трубку вращающейся в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день добавьте твердую сахарозу к суспензии тканевого экстракта до конечной концентрации 1,2 моля.Хорошо перемешать и центрифуга имела 250 000 х г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах буфера гомогенизации, содержащего 1,9 молярной сахарозы методом тритурации и центрифуги при 125 000 х г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования переложите верхний белый твердый слой в свежую трубку и солюбилизируйте один миллилитр ледяного буфера холодной промывки, несколько раз поглаживая вверх и вниз.Поскольку гранула также обогащена амилоидными фибриллами, отбросьте водный средний слой и соедините гранулу с верхним слоем для получения более высокого выхода. Центрифугируйте комбинированные фракции по 8 000 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре ледяного буфера пищеварения и инкубируют при комнатной температуре в течение трех часов на вихре.Снова центрифугируйте образец, затем дважды промыть гранулу в одном миллилитре ледяного холодного буфера Tris и снова центрифуги. После второй промывки повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера солюбилизации путем пипетки вверх и вниз и быстро центрифугируйте трубку при 200 000 х г в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Сохраните гранулу, затем уменьшите концентрацию сахарозы с 1,3 до одного моляра, добавив к супернатанту 50 миллимолярных трисовых буферов.Снова центрифугируют супернатант, затем растворяют как гранулы, так и 100 микролитров буфера Tris, содержащего 0,5% SDS. Для очистки амилоида солюбилизируйте богатые амилоидом гранулы с помощью ультразвуковых волн в устройстве обработки ультразвуком в ванне в течение 20 циклов, затем немедленно центрифугируйте материал при 20 000 х г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах 0,5% буфера SDS Tris и повторите промывку еще четыре раза, После заключительной стадии центрифугирования вымойте гранулу в 200 микролитрах сверхчистой воды и центрифуги 20 000 х г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить все оставшееся моющее средство.Растворите конечную гранулу, содержащую очищенные амилоидные фибриллы, в 100 микролитрах сверхчистой воды. Растворить очищенные 100 микролитров амилоидных фибрилл в 400 микролитрах метанола и вихревой скважине. Затем смешайте в 100 микролитрах хлороформа и снова вихрь.Затем добавьте 300 микролитров сверхчистой воды и тщательно вихрь. После центрифугирования при 12 000 х г в течение двух минут при комнатной температуре аккуратно удалите верхний водный слой, не нарушая интерфейсный слой, содержащий белковую чешуйку, и снова добавьте тот же объем метанола. Повторите центрифугирование, выбросьте супернатант и высушите гранулу на воздухе.Для пищеварения растворите гранулы в 50 микролитрах буфера гуанидина гидрохлорида и сконзвуком на ледяной водяной бане. Затем тщательно вихрь в течение 45 минут до одного часа при комнатной температуре, добавьте 50 микролитров 0,2% раствора поверхностно-активного вещества и снова вихрь еще 60 минут. Далее добавляют один микролитр 500 миллимоляров TCEP и инкубируют в течение 60 минут.Затем добавляют два микролитра 500 миллимолярного йодоацетамида и инкубируют в темноте в течение 20 минут. После инкубации закаляют йодоацетамид пятью микролитрами раствора TCEP в течение 15 минут. Далее добавляют в пробирку необходимый объем 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония для снижения концентрации гуанидина до 1,5 мол.Кроме того, добавьте в трубку 1% раствор поверхностно-активного вещества. Затем добавьте трипсин и оставьте трубку перемешивать при 37 градусах Цельсия на ночь. На следующий день добавьте муравьиную кислоту в переваренный пептидный раствор для снижения рН до 2,0, затем активируйте спиновую колонку C18, добавив 200 микролитров 50% раствора метанола и вращая при 1500 х г в течение двух минут при комнатной температуре.Затем уравновешивайте слои смолы C18, добавляя 200 микролитров буфера равновесия и снова вращаясь в течение двух минут. После уравновешивания загружают подкисленный пептидный раствор на колонку С18 и центрифугу при 1500 х г в течение двух минут при комнатной температуре. Перезагрузите поток, раскрутите столбец и отбросьте второй поток.Затем дважды промыть пептиды, связанные со смолой C18, с помощью промывочного буфера. Элюируют пептид три раза, добавляя 40 микролитров буфера элюирования и центрифугируя колонку. Высушите пептиды в быстром вакуумном концентраторе путем выпаривания водного раствора.Сухие гранулы можно сохранить при температуре 20 градусов Цельсия в течение нескольких недель до анализа РС. Конго красное окрашивание очищенных амилоидов документирует обогащение амилоидных фибрилл по сравнению с растворимой фракцией SDS. Растворимая фракция SDS не показала присутствия амилоидов.Структура очищенных фибрилл подтвердила наличие почти чистых амилоидных фибрилл. Кроме того, маркировка иммунозолотого подтвердила наличие амилоидных бета-42 пептидов. Окрашивание с использованием антиамилоидных бета-42 и антифибрильных антител показало относительное обилие амилоидных бета-42 пептидов в фибриллах.Очищенные амилоидные фракции показали наличие примерно 250 белков, в то время как фракция, собранная перед ультразвуком и промывкой SDS, содержала более 2 500 белков. Ядра Фибриля показали обогащение белков, связанных с немембранными органеллами и супрамолекулярными комплексами. Амилоиды являются видами с низкой численностью, возможно, от нескольких пикограмм до нескольких микрограммов на миллиграммы тканей мозга.Поэтому нужно быть очень осторожным при подборе слоев, поддонов или выбрасывании супернатанта. С развитием этой методики теперь можно более уверенно идентифицировать белки, связанные с исходными амилоидными семенами, охарактеризовать их структуру и нацелить их на терапевтическое вмешательство. Поэтому предотвращая начало этого смертельно опасного заболевания.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Выбор Аптамеры для β-амилоида белка, возбудитель болезни Альцгеймера

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Гистологическая характеристика интактного мозга имплантированных Microdevices и окружающих тканей

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Стереотаксическая Настой олигомерных бета-амилоида в гиппокампе мыши

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Моделирование амилоид β42 токсичности и нейродегенеративные в мозге взрослого данио рерио

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Визуализация амилоида β вкладов в человеческий мозг с матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации изображений масс-спектрометрия

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Маркировка и изображение амилоидных пластин в мозговой ткани с использованием природного полифенола куркумина

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...