Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención R01AG061865 de los NIH a R.J.V. y J.N.S. Los autores agradecen a los miembros del grupo de investigación Vassar y Savas de la Universidad Northwestern por sus discusiones reflexivas. También agradecemos sinceramente a los Dres. Ansgar Seimer y Ralf Langen de la Universidad del Sur de California por su aporte crucial. Agradecemos a la Dra. Farida Korabova por la preparación de muestras y las imágenes de microscopía electrónica de tinción negativa en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Northwestern.

Este protocolo implica el uso de tejidos cerebrales humanos o vertebrados. Toda la investigación se realizó de conformidad con las directrices institucionales aprobadas por la Universidad Northwestern. El flujo de trabajo actual está estandarizado utilizando APP-knock in (AppNL-G-F / NL-G-F) extractos de la región cerebral cortical e hipocampal del cerebro11. Este protocolo ha sido optimizado para extractos cerebrales de ratones a los 6-9 meses de edad, y puede purificar ef...

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	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Desarrollar una comprensión clara de la estructura y composición amiloide es un desafío para los biólogos estructurales y bioquímicos debido a las complejidades biológicas y las limitaciones experimentales en la extracción de fibrillas purificadas de los tejidos cerebrales de la EA16,17. Las fibrillas amiloides son polimórficas a nivel molecular, mostrando una población heterogénea de longitudes y complejidades variables18,19<sup...

El amiloide es una disposición supramolecular extremadamente estable que se encuentra en un panel diverso de proteínas, algunas de las cuales conducen a cambios patológicos1. La acumulación de agregados amiloides intra o extracelulares se observa en varias enfermedades neurodegenerativas2. Los agregados amiloides son heterogéneos y están enriquecidos con un gran número de proteínas y lípidos3. En los últimos años, el interés en el proteoma amiloide ha generado un interés sustancial entre los neurocientíficos básicos y traslacionales. Se han desarrollado varios métodos para extraer y purificar agregados amiloides de tejidos cerebrales humanos de ratón y post mortem. La microdisección de captura láser, la inmunoprecipitación, la descelularización y el aislamiento bioquímico de agregados amiloides son métodos ampliamente utilizados para extraer y purificar placas amiloides, fibrillas y oligómeros 4,5,6,7. Muchos de estos estudios se han centrado en determinar la composición proteica de estos depósitos fibrilares estrechamente empaquetados utilizando EM semicuantitativa. Sin embargo, los resultados disponibles son inconsistentes, y el número sorprendentemente grande de proteínas co-purificadoras previamente reportadas son difíciles de interpretar.
La principal limitación de la literatura existente que describe el proteoma del núcleo amiloide en los cerebros modelo de ratón con EA y EA es que el material purificado contiene un número inmanejable de proteínas copurificantes. El objetivo general de este método es superar esta limitación y desarrollar una purificación bioquímica robusta para aislar los núcleos de fibrillas amiloides. Esta estrategia emplea un método bioquímico basado en la ultracentrifugación de gradiente de densidad de sacarosa previamente descrito para el aislamiento de fracciones amiloides enriquecidas insolubles de SDS de tejidos cerebrales humanos y de ratón post mortem AD 8,9. Este método se basa en la literatura existente, pero va más allá con la ultrasonicación y los lavados SDS para eliminar la mayoría de las proteínas asociadas a amiloides unidas libremente, lo que lleva al aislamiento de fibrillas amiloides altamente purificadas (Figura 1). Las fibrillas purificadas por este protocolo superan varios desafíos existentes que se encuentran con frecuencia en los estudios estructurales de fibrillas amiloides aisladas de extractos cerebrales. La visualización de estas fibrillas con microscopía electrónica de transmisión (TEM) confirma la integridad y pureza del material purificado (Figura 2). En este estudio, las fibrillas aisladas se solubilizan y se digieren en péptidos con tripsina, y el análisis de EM sin etiqueta puede revelar fácilmente la identidad de las proteínas que forman el núcleo de la fibrilla. En particular, algunas de estas proteínas tienen una tendencia inherente a formar ensamblajes supramoleculares en orgánulos no unidos a la membrana. Además, muchas de las proteínas identificadas en el análisis de las fibrillas beta-amiloides (Aβ) también están asociadas con otras enfermedades neurodegenerativas, lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel clave en múltiples proteinopatías.
Es poco probable que este método SDS / ultrasonido altere o interrumpa la estructura de los núcleos de la fibrilla. El material purificado también es adecuado para una amplia gama de enfoques de análisis proteómico de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba y estrategias adicionales de análisis estructural basadas en EM, como la reticulación química o el intercambio de hidrógeno-deuterio. La recuperación general utilizando este método es relativamente alta y, por lo tanto, es adecuada para estudios estructurales detallados, que requieren microgramos a miligramos del material purificado. El material purificado también es adecuado para estudios estructurales utilizando crioEM y microscopía de fuerza atómica. Este protocolo, en combinación con el etiquetado isotópico estable de mamíferos, puede facilitar los estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) en estado sólido de la estructura amiloide10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Las inclusiones fibrilares proteínicas son características patológicas clave de múltiples enfermedades neurodegenerativas. En las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer (EA), los péptidos beta amiloides forman protofibrillas en el espacio extracelular, que actúan como semillas que crecen gradualmente y maduran en grandes placas amiloides. A pesar de esta comprensión básica, el conocimiento actual de la estructura de la fibrilla amiloide, la composición y los patrones de deposición en el cerebro es limitado. Una barrera importante ha sido la incapacidad de aislar fibrillas amiloides altamente purificadas de los extractos cerebrales. La purificación por afinidad y los enfoques basados en microdisección de captura láser se han utilizado anteriormente para aislar amiloides, pero están limitados por la pequeña cantidad de material que se puede recuperar. Este protocolo novedoso y robusto describe la purificación bioquímica de los núcleos de placa amiloide utilizando solubilización de dodecil sulfato de sodio (SDS) con ultracentrifugación y ultrasonido de gradiente de densidad de sacarosa y produce fibrillas altamente puras de pacientes con EA y tejidos cerebrales modelo de EA. El análisis proteómico ascendente basado en espectrometría de masas (EM) del material purificado representa una estrategia sólida para identificar casi todos los componentes proteicos primarios de las fibrillas amiloides. Estudios proteómicos previos de proteínas en las coronas amiloides han revelado una colección inesperadamente grande y funcionalmente diversa de proteínas. En particular, después de refinar la estrategia de purificación, el número de proteínas copurificantes se redujo en más de 10 veces, lo que indica la alta pureza del material insoluble SDS aislado. La tinción negativa y la microscopía electrónica de inmuno-oro permitieron confirmar la pureza de estas preparaciones. Se requieren más estudios para comprender los atributos espaciales y biológicos que contribuyen a la deposición de estas proteínas en inclusiones amiloides. En conjunto, esta estrategia analítica está bien posicionada para aumentar la comprensión de la biología amiloide.

Aquí, se resume un método detallado para el aislamiento y purificación de fibrillas amiloides utilizando un método de purificación de ultracentrifugación de gradiente de densidad de sacarosa modificado (ver Figura 1). La innovación en este método es la inclusión de pasos de lavado basado en ultrasonidos utilizando un sistema de sonicación en baño de agua seguido de solubilización SDS, que elimina muchas proteínas vagamente asociadas de las fibrillas amiloides que se co-purifican...

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Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Las placas amiloides son necesarias para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, no son suficientes. A pesar de este hecho, siguen siendo enigmáticos debido en parte a los desafíos en la caracterización de sus contenidos.Nuestro protocolo es altamente eficiente para aislar fibrillas amiloides de alta pureza y es muy adecuado para comprender los detalles finos de la estructura y la composición. Conocer el contenido de proteínas de las placas amiloides puede ayudar a identificar los objetivos de la intervención terapéutica que pueden retrasar, interferir o prevenir su acumulación. Por lo tanto, retrasar el inicio de la enfermedad.Este método es muy adecuado para extraer depósitos de proteínas de tejidos cerebrales degenerados y agregados de proteínas en diferentes otras vías de proteínas. Comience colocando una región de tejido cerebral recién diseccionada o congelada en un tubo de dos mililitros que contenga de seis a ocho cuentas de cerámica en un tampón de homogeneización helado recién preparado. Luego muele el tejido usando un homogeneizador de molino de cuentas a 4, 000 rpm con dos ciclos de 30 segundos de pulso de encendido y apagado.Ahora agregue nueve mililitros de tampón de homogeneización helada al mililitro de homogeneizado de tejido cerebral y un tubo y sello de 15 mililitros con tiras de película de cera de laboratorio. Para garantizar una solubilización robusta, mantenga el tubo girando durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, agregue sacarosa sólida a la suspensión de extracto de tejido a una concentración final de 1.2 moles.Mezclar bien y la centrífuga tuvo 250.000 x g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de tampón de homogeneización que contenga 1.9 sacarosa molar triturando y centrifugando a 125, 000 x g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera la capa sólida blanca superior a un tubo fresco y solubilice un mililitro de tampón de lavado helado acariciando hacia arriba y hacia abajo varias veces.Dado que el pellet también está enriquecido con fibrillas amiloides, deseche la capa media acuosa y combine el pellet con la capa superior para un mayor rendimiento. Centrifugar las fracciones combinadas a 8.000 x g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de digestión helada e incube a temperatura ambiente durante tres horas en un vórtice.Centrifugar la muestra de nuevo, luego lavar el pellet dos veces en un mililitro de tampón Tris helado y centrifugar de nuevo. Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de solubilización mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo y centríe rápidamente el tubo a 200, 000 x g durante 60 minutos a cuatro grados Centígrados. Guarde el pellet, luego reduzca la concentración de sacarosa de 1.3 a un molar agregando un tampón Tris milimolar 50 milimolares al sobrenadante.Centrifugar el sobrenadante de nuevo, luego disolver tanto los gránulos como 100 microlitros de tampón Tris que contienen 0.5% SDS. Para la purificación amiloide, solubilice los gránulos ricos en amiloide utilizando ondas de ultrasonido en un dispositivo de sonicación de baño durante 20 ciclos, luego centríe inmediatamente el material a 20, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón 0.5% SDS Tris y repita el lavado cuatro veces más, Después del paso de centrifugación final, lave el pellet en 200 microlitros de agua ultrapura y centrífique 20, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier detergente restante.Disuelva el pellet final que contiene fibrillas amiloides purificadas en 100 microlitros de agua ultrapura. Disuelva bien los 100 microlitros purificados de fibrillas amiloides en 400 microlitros de metanol y vórtice. Luego mezcle 100 microlitros de cloroformo y vórtice nuevamente.A continuación, agregue 300 microlitros de agua ultrapura y vórtice a fondo. Después de la centrifugación a 12, 000 x g durante dos minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la capa acuosa superior sin perturbar la capa de interfaz que contiene la escama de proteína y agregue el mismo volumen de metanol nuevamente. Repita la centrifugación, deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet.Para la digestión, disuelva el pellet en 50 microlitros de tampón de clorhidrato de guanidina y sonicato en un baño de agua helada. Luego vórtice a fondo durante 45 minutos a una hora a temperatura ambiente, agregue 50 microlitros de solución de surfactante al 0.2% y vórtice nuevamente durante otros 60 minutos. A continuación, agregue un microlitro de TCEP de 500 milimolares e incube durante 60 minutos.Luego agregue dos microlitros de yodoacetamida milimolar de 500 e incube en la oscuridad durante 20 minutos. Después de la incubación, apague la yodoacetamida con cinco microlitros de solución de TCEP durante 15 minutos. A continuación, agregue el volumen requerido de solución de bicarbonato de amonio milimolar de 50 milimolares al tubo para reducir la concentración de guanidina a 1.5 moles.Además, agregue una solución de surfactante al 1% al tubo. Luego agregue tripsina y deje el tubo mezclando a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue ácido fórmico a la solución peptídica digerida para reducir el pH a 2.0, luego active la columna de espín C18 agregando 200 microlitros de solución de metanol al 50% e hilando a 1500 x g durante dos minutos a temperatura ambiente.A continuación, equilibre los lechos de resina de columna C18 agregando 200 microlitros de tampón de equilibrio y girando nuevamente durante dos minutos. Después del equilibrio, cargue la solución peptídica acidificada en la columna C18 y centrífuga a 1500 x g durante dos minutos a temperatura ambiente. Vuelva a cargar el flujo, gire la columna y descarte el segundo flujo.Luego lave los péptidos unidos a la resina C18 dos veces con el tampón de lavado. Eluya el péptido tres veces agregando 40 microlitros de tampón de elución y centrifugando la columna. Seque los péptidos en un concentrador de vacío de velocidad evaporando la solución acuosa.Los gránulos secos se pueden guardar a 20 grados centígrados durante unas semanas antes del análisis de EM. La tinción roja del Congo de amiloides purificados documenta el enriquecimiento de las fibrillas amiloides en comparación con la fracción soluble de SDS. La fracción soluble de SDS no mostró la presencia de amiloides.La estructura de las fibrillas purificadas confirmó la presencia de fibrillas amiloides casi puras. Además, el marcado de inmunogold confirmó la presencia de péptidos beta-42 amiloides. La tinción con anticuerpos anti-beta-amiloide beta-42 y anti-fibrilla mostró una abundancia relativa de péptidos beta-42 amiloides en las fibrillas.Las fracciones de amiloide purificado mostraron la presencia de aproximadamente 250 proteínas, mientras que la fracción recolectada antes de la ultrasonicación y el lavado de SDS contenía más de 2, 500 proteínas. Los núcleos de fibrillas mostraron enriquecimiento de proteínas asociadas con orgánulos no unidos a la membrana y complejos supramoleculares. Los amiloides son especies de baja abundancia, tal vez de unos pocos picogramos a pocos microgramos por miligramo de tejidos cerebrales.Por lo tanto, debe tener mucho cuidado al recoger las capas, paletas o desechar el sobrenadante. Con el desarrollo de esta técnica, ahora puede identificar con más confianza las proteínas asociadas con las semillas amiloides iniciales, caracterizar su estructura y dirigirse a ellas para la intervención terapéutica. Por lo tanto, prevenir la aparición de esta enfermedad mortal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Investigación

Neurociencias

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...