Name: biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidraget R01AG061865 till R.J.V. och J.N.S. Författarna tackar Vassar och Savas forskargruppsmedlemmar vid Northwestern University för deras tankeväckande diskussioner. Vi tackar också uppriktigt Dr (s). Ansgar Seimer och Ralf Langen vid University of South California för deras avgörande insats. Vi tackar Dr Farida Korabova för provberedning och negativ färgning av elektronmikroskopi vid Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Detta protokoll innefattar användning av mänskliga eller ryggradsdjur hjärnvävnader. All forskning utfördes i enlighet med de godkända institutionella riktlinjerna från Northwestern University. Det aktuella arbetsflödet är standardiserat med hjälp av APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) mushjärna kortikala och hippocampus hjärnregion extrakt11. Detta protokoll har optimerats för hjärnextrakt från möss vid 6-9 månaders ålder, och det kan effektivt rena amyloider fr?...

<ol>
	<li>Willbold, D., Strodel, B., Schr&#246;der, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids.">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li><li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibrils:+abnormal+protein+assembly.">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li><li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease:+New+clues,+new+challenges.">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li><li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils.">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).</li><li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques.">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li><li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies.">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li><li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+brain+A&#946;+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis.">Unveiling brain A&#946; heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li><li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+toxicity+of+A&#946;-(1-42)+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer's+disease.">Morphology and toxicity of A&#946;-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li><li>Lu, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+&#946;-amyloid+fibrils+in+Alzheimer's+disease+brain+tissue.">Molecular structure of &#946;-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure.">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).</li><li>Spijker, S., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).</li><li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer's+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals.">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions.">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).</li><li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+structure:+conformational+diversity+and+consequences.">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li><li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+&amp;+imperfect+ageing:+Technological+limitations+and+challenges.">Neurodegeneration &amp; imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).</li><li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM.">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li><li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+polymorphism:+almost+identical+on+the+atomic+level,+mesoscopically+very+different.">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li><li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism.">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).</li><li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+polymorphism:+Structural+basis+and+neurobiological+relevance.">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li><li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Amyloid+&#946;+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure.">Heterotypic Amyloid &#946; interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).</li><li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer's+disease.">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li><li>Luo, J., W&#228;rml&#228;nder, S. K., Gr&#228;slund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-&#946;+peptide+and+other+amyloid+proteins:+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-&#946; peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li><li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington's+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function.">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li><li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible,+specific,+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress.">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li><li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles.">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).</li><li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease+brain.">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li><li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases.">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li><li>F&#228;ndrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+Alzheimer's+&#946;-amyloid+structures.">Recent progress in understanding Alzheimer's &#946;-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li><li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover.">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li><li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+spatial+A&#946;+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer's+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics.">Following spatial A&#946; aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li><li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures.">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li><li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain.">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).</li></ol>

Att utveckla en tydlig förståelse för amyloidstruktur och sammansättning är utmanande för strukturbiologer och biokemister på grund av de biologiska komplexiteterna och experimentella begränsningarna vid extraktion av renade fibriller från AD-hjärnvävnader16,17. Amyloidfibriller är polymorfa på molekylär nivå och visar en heterogen population av varierande längd och komplexitet18,19. För ...

Amyloid är ett extremt stabilt supramolekylärt arrangemang som finns i en mångsidig panel av proteiner, av vilka några leder till patologiska förändringar1. Ackumuleringen av intra- eller extracellulära amyloidaggregat observeras i flera neurodegenerativa sjukdomar2. Amyloidaggregat är heterogena och berikas med ett stort antal proteiner och lipider3. Under de senaste åren har intresset för amyloidproteomet genererat ett stort intresse bland grundläggande och translationella neuroforskare. Flera metoder har utvecklats för att extrahera och rena amyloidaggregat från mus- och obduktionsvävnader i hjärnan. Laserfångande mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering och biokemisk isolering av amyloidaggregat används ofta metoder för att extrahera och rena amyloidplack, fibriller och oligomerer 4,5,6,7. Många av dessa studier har fokuserat på att bestämma proteinsammansättningen hos dessa tätt packade fibrillära avlagringar med hjälp av semikvantitativ MS. De tillgängliga resultaten är dock inkonsekventa, och det förvånansvärt stora antalet samrenande proteiner som tidigare rapporterats är utmanande att tolka.
Den primära begränsningen i den befintliga litteraturen som beskriver amyloidkärnans proteom i AD- och AD-musmodellhjärnor är att det renade materialet innehåller ett ohanterligt antal samrenande proteiner. Det övergripande målet med denna metod är att övervinna denna begränsning och utveckla en robust biokemisk rening för isolering av amyloidfibrilkärnor. Denna strategi använder en tidigare beskriven sackarosdensitetsgradient ultracentrifugeringsbaserad biokemisk metod för isolering av SDS olösliga berikade amyloidfraktioner från post mortem AD mänskliga och mus hjärnvävnader 8,9. Denna metod bygger på den befintliga litteraturen men går längre med ultraljud och SDS tvättar för att ta bort de flesta av de löst bundna amyloidassocierade proteinerna, vilket leder till isolering av högrenade amyloidfibriller (Figur 1). Fibrillerna renade av detta protokoll övervinner flera befintliga utmaningar som ofta uppstår i strukturella studier av amyloidfibriller isolerade från hjärnextrakt. Visualisering av dessa fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekräftar det renade materialets integritet och renhet (figur 2). I denna studie solubiliseras de isolerade fibrillerna och smälts till peptider med trypsin, och etikettfri MS-analys kan lätt avslöja identiteten hos proteinerna som bildar fibrilkärnan. I synnerhet har några av dessa proteiner en inneboende tendens att bilda supramolekylära sammansättningar i icke-membranbundna organeller. Dessutom är många av de proteiner som identifierats i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibriller också associerade med andra neurodegenerativa sjukdomar, vilket tyder på att dessa proteiner kan spela en nyckelroll i flera proteinopatier.
Denna SDS/ultraljud metod är osannolikt att ändra eller störa strukturen av fibril kärnor. Det renade materialet är också lämpligt för ett brett spektrum av top-down och bottom-up proteomiska analysmetoder och ytterligare MS-baserade strukturella analysstrategier, såsom kemisk tvärbindning eller väte-deuteriumutbyte. Den totala återvinningen med denna metod är relativt hög och är således lämplig för detaljerade strukturella studier, som kräver mikrogram till milligram av det renade materialet. Det renade materialet är också lämpligt för strukturella studier med kryoEM och atomkraftmikroskopi. Detta protokoll, i kombination med den stabila isotopmärkningen av däggdjur, kan underlätta fast-state kärnmagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20&#160;mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td rowspan="35">Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>803001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>800701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody</td>
			<td>IBL America</td>
			<td>10323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-amyloid fibril LOC antibody</td>
			<td>&#160;EMD Millipore</td>
			<td>AB2287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete&#160; Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSep C18 Cartridges</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60108-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrated Proteomics Pipeline - IP2&#160;</td>
			<td>http://www.integratedproteomics.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K54 Tissue Homogenizing System Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>Glas-Col 099C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://www.maxquant.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoviper 75 &#956;m x 50&#160;cm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164942</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>BR-8101P-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Spin Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 tissue homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2072</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RawConverter</td>
			<td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vaccum Concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7315021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold-Mass spec grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical purification and proteomic characterization of amyloid fibril cores from the brain

Proteinhaltiga fibrillära inneslutningar är viktiga patologiska kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar. I de tidiga stadierna av Alzheimers sjukdom (AD) bildar amyloid-beta-peptider protofibriller i det extracellulära utrymmet, som fungerar som frön som gradvis växer och mognar till stora amyloidplack. Trots denna grundläggande förståelse är nuvarande kunskap om amyloidfibrilstruktur, sammansättning och deponeringsmönster i hjärnan begränsad. En viktig barriär har varit oförmågan att isolera högrenade amyloidfibriller från hjärnextrakt. Affinitetsrening och laserfångande mikrodissektionsbaserade metoder har tidigare använts för att isolera amyloider men begränsas av den lilla mängd material som kan återvinnas. Detta nya, robusta protokoll beskriver den biokemiska reningen av amyloida plackkärnor med användning av natriumdodecylsulfat (SDS) solubilisering med sackarosdensitetsgradient ultracentrifugering och ultraljud och ger mycket rena fibriller från AD-patienter och AD-modell hjärnvävnader. Masspektrometri (MS) -baserad bottom-up proteomisk analys av det renade materialet representerar en robust strategi för att identifiera nästan alla primära proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidigare proteomiska studier av proteiner i amyloidkoronan har avslöjat en oväntat stor och funktionellt varierad samling proteiner. Särskilt, efter raffinering av reningsstrategin, reducerades antalet samrenande proteiner med mer än 10 gånger, vilket indikerar den höga renheten hos det isolerade SDS-olösliga materialet. Negativ färgning och immuno-guldelektronmikroskopi möjliggjorde bekräftelse av renheten hos dessa preparat. Ytterligare studier krävs för att förstå de rumsliga och biologiska attribut som bidrar till avsättningen av dessa proteiner till amyloidinklusioner. Sammantaget är denna analytiska strategi väl positionerad för att öka förståelsen för amyloidbiologi.

Här sammanfattas en detaljerad metod för isolering och rening av amyloidfibriller med användning av en modifierad ultracentrifugeringsmetod för sackarosdensitetsgradient (se figur 1). Innovationen i denna metod är införandet av steg av ultraljudsbaserad tvätt med hjälp av ett vattenbad ultraljudsbehandlingssystem följt av SDS-solubilisering, som tar bort många löst associerade proteiner från amyloidfibrillerna som samrenar med de mycket täta och rena fibrillerna. Ultraljudsstege...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain at JoVE.com

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Denna biokemiska reningsmetod med masspektrometribaserad proteomisk analys underlättar robust karakterisering av amyloidfibrilkärnor, vilket kan påskynda identifieringen av mål för att förebygga Alzheimers sjukdom.

Biokemisk rening och proteomisk karakterisering av amyloidfibrilkärnor från hjärnan

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Amyloida plack krävs för diagnos av Alzheimers sjukdom. Men de räcker inte. Trots detta faktum förblir de gåtfulla delvis på grund av utmaningar med att karakterisera deras innehåll.Vårt protokoll är mycket effektivt för att isolera amyloidfibriller vid hög renhet och är väl lämpat för att förstå de fina detaljerna i struktur och sammansättning. Att känna till proteininnehållet i amyloida plack kan hjälpa till att identifiera målen för terapeutisk ingrepp som kan fördröja, störa eller förhindra deras ackumulering. Därför fördröjer sjukdomsuppkomsten.Denna metod är väl lämpad för att extrahera proteinavlagringar från degenererade hjärnvävnader och proteinaggregat i olika andra proteinvägar. Börja med att placera en nyligen dissekerad eller snäppfrusen hjärnvävnadsregion i ett två milliliter rör som innehåller sex till åtta keramiska pärlor i nyberedd iskall homogeniseringsbuffert. Slipa sedan vävnaden med en pärlkvarnshomogenisator vid 4 000 rpm med två cykler på 30 sekunder på och av puls.Tillsätt nu nio milliliter iskall homogeniseringsbuffert till en milliliter hjärnvävnadshomogenat och ett 15 ml rör och försegla med laboratorievaxfilmremsor. För att säkerställa robust solubilisering, håll röret roterande över natten vid fyra grader Celsius. Följande dag tillsätt fast sackaros till vävnadsextraktsuspensionen till en slutlig koncentration av 1,2 mol.Blanda väl och centrifugen hade 250 000 x g i 45 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha kasserat supernatanten, återsuspendera pelleten i två milliliter homogeniseringsbuffert innehållande 1,9 molär sackaros genom triturering och centrifugering vid 125 000 x g i 45 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering överför det övre vita fasta skiktet till ett nytt rör och solubilisera en milliliter iskall tvättbuffert genom att klappa upp och ner flera gånger.Eftersom pelleten också är berikad med amyloidfibriller, kassera det vattenhaltiga mellanskiktet och kombinera pelleten med toppskiktet för ett högre utbyte. Centrifugera de kombinerade fraktionerna vid 8 000 x g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha kasserat supernatanten, återsuspendera pelleten i en milliliter iskall matsmältningsbuffert och inkubera vid rumstemperatur i tre timmar på en virvel.Centrifugera provet igen, tvätta sedan pelleten två gånger i en milliliter iskall Tris-buffert och centrifugera igen. Efter den andra tvätten, återsuspendera pelleten i en milliliter solubiliseringsbuffert genom att pipettera upp och ner och centrifugera snabbt röret vid 200 000 x g i 60 minuter vid fyra grader Celsius. Spara pelleten och minska sedan sackaroskoncentrationen från 1,3 till en molar genom att tillsätta 50 millimolar Tris-buffert till supernatanten.Centrifugera supernatanten igen och lös sedan upp både pellets och 100 mikroliter Tris-buffert innehållande 0,5% SDS. För amyloidrening, solubilisera de amyloidrika pellets med hjälp av ultraljudsvågor i en bad ultraljudsbehandlingsanordning i 20 cykler, centrifugera sedan omedelbart materialet vid 20 000 x g i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Resuspendera pelleten i 500 mikroliter med 0,5% SDS Tris-buffert och upprepa tvätten ytterligare fyra gånger, Efter det sista centrifugeringssteget, tvätta pelleten i 200 mikroliter ultrarent vatten och centrifugera 20 000 x g i 30 minuter vid fyra grader Celsius för att ta bort eventuellt återstående tvättmedel.Lös upp den slutliga pelleten som innehåller renade amyloidfibriller i 100 mikroliter ultrarent vatten. Lös upp de renade 100 mikroliterna av amyloidfibriller i 400 mikroliter metanol och virvelbrunn. Blanda sedan i 100 mikroliter kloroform och virvel igen.Tillsätt sedan 300 mikroliter ultrarent vatten och virvel noggrant. Efter centrifugering vid 12 000 x g i två minuter vid rumstemperatur, ta försiktigt bort det övre vattenhaltiga skiktet utan att störa gränssnittsskiktet som innehåller proteinflingan och tillsätt samma volym metanol igen. Upprepa centrifugeringen, kassera supernatanten och lufttorka pelleten.För matsmältning, lösa pelleten i 50 mikroliter av guanidinhydrokloridbuffert och sonikat i ett iskallt vattenbad. Sedan virvla noggrant i 45 minuter till en timme vid rumstemperatur, tillsätt 50 mikroliter av 0,2% ytaktiv lösning och virvel igen i ytterligare 60 minuter. Tillsätt sedan en mikroliter på 500 millimolär TCEP och inkubera i 60 minuter.Tillsätt sedan två mikroliter med 500 millimolär jodacetamid och inkubera i mörkret i 20 minuter. Efter inkubationen släck iodoacetamiden med fem mikroliter TCEP-lösning i 15 minuter. Tillsätt sedan den erforderliga volymen 50 millimolär ammoniumbikarbonatlösning till röret för att minska guanidinkoncentrationen till 1,5 mol.Tillsätt också 1% ytaktiv lösning till röret. Tillsätt sedan trypsin och låt röret blandas vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag tillsätt myrsyra till den smälta peptidlösningen för att sänka pH till 2,0, aktivera sedan C18-spinnkolonnen genom att tillsätta 200 mikroliter 50% metanollösning och snurra vid 1500 x g i två minuter vid rumstemperatur.Därefter balanserar du C18-kolonnhartsbäddarna genom att tillsätta 200 mikroliter jämviktsbuffert och snurra igen i två minuter. Efter jämvikt, ladda den surgjorda peptidlösningen på C18-kolonnen och centrifugera vid 1500 x g i två minuter vid rumstemperatur. Ladda om flödet genom, snurra kolonnen och kasta det andra flödet igenom.Tvätta sedan peptiderna bundna till C18-hartset två gånger med tvättbufferten. Elue peptiden tre gånger genom att tillsätta 40 mikroliter elueringsbuffert och centrifugera kolonnen. Torka peptiderna i en hastighetsvakuumkoncentrator genom att förånga den vattenhaltiga lösningen.De torra pelletsen kan sparas vid 20 grader Celsius i några veckor före MS-analysen. Kongoröd färgning av renade amyloider dokumenterar anrikningen av amyloidfibrillerna jämfört med den SDS-lösliga fraktionen. DEN SDS-lösliga fraktionen visade inte närvaron av amyloider.Strukturen hos de renade fibrillerna bekräftade närvaron av nästan rena amyloidfibriller. Immunogoldmärkning bekräftade också närvaron av amyloid beta-42 peptider. Färgning med anti-amyloid beta-42 och anti-fibrilantikroppar visade ett relativt överflöd av amyloid beta-42-peptider i fibriller.Renade amyloidfraktioner visade närvaron av cirka 250 proteiner, medan fraktionen som samlades in före ultraljud och SDS-tvätt innehöll mer än 2 500 proteiner. Fibrilkärnor visade anrikning av proteiner associerade med icke-minnesbundna organeller och supramolekylära komplex. Amyloider är arter med låg förekomst, kanske några pikogram till få mikrogram per milligram hjärnvävnader.Så du måste vara mycket försiktig när du plockar upp lagren, pallarna eller kasserar supernatanten. Med utvecklingen av denna teknik kan du nu mer säkert identifiera proteiner associerade med de ursprungliga amyloidfröna, karakterisera deras struktur och rikta dem för terapeutisk ingrepp. Därför förhindrar uppkomsten av denna dödliga sjukdom.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Selection of Aptamers for Amyloid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Val av aptamers för Amyloid β-protein, vilka smittämnen av Alzheimers sjukdom

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk karakterisering av Brain-implanterade Microdevices och omgivande vävnad

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion av oligomera amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toxicitet och Neurodegeneration i vuxna zebrafiskar hjärnan

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisering av Amyloid β insättningar i den mänskliga hjärnan med Matrix-assisted Laser Desorption/jonisering Imaging masspektrometri

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rening av dendritiska Filopodia-rik fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Märkning och avbildning av amyloida plack i hjärnvävnad med hjälp av naturliga polyfenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...