Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

نشكر المرضى وأولياء الأمور الذين شاركوا في هذه الدراسة. نشكر عبيدة بيبي على كل أعمال الزراعة مع الكائنات العضوية. نشكر إلس إيرتجيرتس ، وكارولين برونيل ، وكلير كولارد ، وليليان كوليجنون ، ومونيك ديلفوس ، وأنجا ديلبورت ، وناتالي فيارتس ، وسيسيل لامبريمونت ، ولوت نيوبورج ، وناتالي بيترز ، وآن رامان ، وبيم سانسن ، وهيلدا ستيفنز ، وماريان شولت ، وإلس فان رانسبيك ، وكريستل فان دي براندي ، وجريت فان دن إيندي ، ومارلين فاندركيركين ، وإنجي فان ديك ، وأودري فاجنر ، ومونيكا واسكيفيتش ، وبرنارد ويندريكس على الدعم اللوجستي. كما نشكر Mucovereniging / Association Muco ، وتحديدا ستيفان جوريس والدكتور جان فانليوي ، على دعمهم وتمويلهم. نشكر جميع المتعاونين من مشروع Organoid البلجيكي: هيدويج بوبولي (CHR Citadelle ، لييج ، بلجيكا) ، ليندا بولانجر (مستشفيات جامعة لوفين ، بلجيكا) ، جورج كازيمير (HUDERF ، بروكسل ، بلجيكا) ، بنديكت دي ماير (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، Elke De Wachter (مستشفى جامعة بروكسل ، بلجيكا) ، داني دي لوز (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، إيزابيل إتيان (CHU Erasme ، بروكسل ، بلجيكا) ، لورانس هانسينس (HUDERF ، بروكسل) ، كريستيان نوب (CHU Erasme ، بروكسل ، بلجيكا) ، مونيك ليكين (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا) ، فيكي نوي (مستشفى GZA St. Vincentius في أنتويرب) ، ديرك ستايسن (مستشفى GZA St. Vincentius في أنتويرب) ، ستيفاني فان بيرفليت (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، إيفا فان برايكل (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، كيم فان هورنبيك (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا) ، إيف فاندرهيلست (مستشفى جامعة بروكسل ، بلجيكا) ، Stijn Verhulst (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا)، ستيفاني فينكن (مستشفى جامعة بروكسل، بلجيكا).

بالنسبة لجميع الإجراءات التي تنطوي على الأنسجة البشرية ، تم الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات Research UZ/KU Leuven (أبحاث EC). تم إجراء جميع الأبحاث بموافقة مستنيرة و / أو موافقة من الآباء والممثلين و / أو المرضى.
ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على خزعات المستقيم والمواد ا...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+cystic+fibrosis:+Consensus+guidelines+from+the+cystic+fibrosis+foundation.">Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation.</a> The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).</li><li>Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+variability+of+the+sweat+chloride+in+diagnostic+sweat+tests:+A+retrospective+analysis.">Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).</li><li>Friedmacher, F., Puri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+suction+biopsy+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease:+a+systematic+review+of+diagnostic+accuracy+and+complications.">Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications.</a> Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis.">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA). قام المؤشران المحسوبان باستخدام ROMA و IR و CI ، بتمييز الكائنات العضوية عن الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي عن أولئك الذين لا يعانون من التليف الكيسي بدقة تامة. وبالتالي يمكن أن تعمل ROMA كاختبار CFTR فسيولوجي جديد مكمل ل SCC والاختبا...

التليف الكيسي (CF) هو مرض صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء CF (CFTR). بروتين CFTR عبارة عن قناة كلوريد وبيكربونات ، مما يضمن ترطيب العديد من الظهارة1. التليف الكيسي هو مرض عالي العبء ، يقصر العمر ، متعدد الأنظمة ، ويظهر في المقام الأول كمرض تنفسي ، ولكنه يؤثر أيضا على الجهاز الهضمي والبنكرياس والكبد والجهاز التناسلي2.
تؤدي طفرات CFTR المسببة للأمراض إلى انخفاض في كمية أو وظيفة CFTR ، مما يؤدي بدوره إلى جفاف المخاط. تم وصف أكثر من 2000 متغير في جين CFTR 3 ، منها 466 فقط تم توصيفها بدقة4.
يمكن إجراء تشخيص التليف الكيسي عندما يكون تركيز كلوريد العرق (SCC) أعلى من عتبة 60 مليمول / لتر أو عندما يتم تحديد طفرتين من CFTR المسببة للأمراض (وفقا لقاعدة بيانات CFTR2) 4,5. في الأشخاص الذين لديهم SCC مرتفع بشكل متوسط فقط (30-60 مليمول / لتر) ، والذي يحدث في حوالي 4٪ -5٪ من اختبارات العرق6 ، وطفرات CFTR ذات العواقب السريرية المتفاوتة أو غير المعروفة ، لا يمكن تأكيد التشخيص أو استبعاده ، حتى عندما يكون لديهم أعراض متوافقة مع التليف الكيسي أو اختبار فحص حديثي الولادة إيجابي. بالنسبة لهذه الحالات ، تم تضمين فحوصات CFTR الفسيولوجية للخط الثاني (فرق الجهد الأنفي (NPD) وقياسات التيار المعوي (ICM)) في خوارزمية التشخيص. هذه الاختبارات ليست متاحة بسهولة في معظم المراكز ولا يمكن إجراؤها في جميع الأعمار ، خاصة عند الرضع5.
العضويات الشرجية هي هياكل ثلاثية الأبعاد نمت من Lgr5 (+) الخلايا الجذعية المعوية البالغة من الخبايا المعوية التي تم الحصول عليها من خلال خزعة المستقيم7. يتم استخدام المواد العضوية بشكل متزايد في الأبحاث الطبية الحيوية ، مثل اختبار علاج المغير في CF8. يمكن الحصول على خزعة قابلة للحياة إما عن طريق الشفط أو خزعة الملقط ، وهو إجراء لا يسبب سوى الحد الأدنى من الانزعاج وهو آمن حتى عند الرضع ، مع معدلات مضاعفات منخفضة9. يتم إثراء الخبايا المعزولة من خزعات المستقيم في الخلايا الجذعية ، وفي ظل ظروف زراعة محددة ، يتم تنظيمها ذاتيا في عضويات مستقيمية. يتم تحديد مورفولوجيا هذه المواد العضوية من خلال التعبير عن وظيفة CFTR ، الموجودة في الغشاء القمي للخلايا الظهارية. يسمح CFTR الوظيفي للكلوريد والماء بدخول التجويف العضوي ، مما يؤدي إلى تورم المواد العضوية غير CF. لا تنتفخ عضويات CF وليس لها تجويف مرئي10,11.
يسمح تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA) بالتمييز بين الكائنات العضوية CF وغير CF بناء على هذه الاختلافات في التشكل العضوي. المواد العضوية غير CF أكثر استدارة ولها تجويف مرئي ، في حين أن العكس صحيح بالنسبة للعضويات CF. لهذا الفحص ، يتم طلاء المواد العضوية الخاصة بالمريض في 32 بئرا من صفيحة 96 بئرا. بعد 1 يوم من النمو ، يتم تلطيخ المواد العضوية باللون الأخضر الكالسيين وتصويرها في مجهر متحد البؤر. تظهر المواد العضوية غير CF شكلا دائريا أكثر وجزءا مركزيا أقل فلورية ، حيث يحتوي التجويف على بقع سائلة وكالسيين خلايا فقط. يتم قياس هذه الاختلافات في التشكل باستخدام مؤشرين ROMA: مؤشر الدائرية (CI) يحدد استدارة المواد العضوية ، في حين أن نسبة الشدة (IR) هي مقياس لوجود أو عدم وجود تجويف مركزي. في هذا التقرير ، نصف بالتفصيل بروتوكول الحصول على هذه الفهارس التمييزية ، للسماح بتكرار التقنية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

تشخيص التليف الكيسي (CF) ليس دائما مباشرا ، خاصة عندما يكون تركيز كلوريد العرق متوسطا و / أو يمكن تحديد أقل من طفرتين من CFTR المسببة للمرض. تم تضمين فحوصات CFTR الفسيولوجية (فرق جهد الأنف ، قياس التيار المعوي) في خوارزمية التشخيص ولكنها ليست دائما متاحة بسهولة أو مجدية (على سبيل المثال ، عند الرضع). عضويات المستقيم هي هياكل 3D التي تنمو من الخلايا الجذعية المعزولة من خبايا خزعة المستقيم عند زراعتها في ظل ظروف محددة. المواد العضوية من الموضوعات غير CF لها شكل دائري وتجويف مملوء بالسوائل ، حيث أن نقل الكلوريد بوساطة CFTR يدفع الماء إلى التجويف. لا تنتفخ المواد العضوية ذات وظيفة CFTR المعيبة ، وتحتفظ بشكل غير منتظم وليس لها تجويف مرئي. يتم تحديد الاختلافات في التشكل بين المواد العضوية CF وغير CF في "تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي" (ROMA) كاختبار فسيولوجي CFTR جديد. بالنسبة لفحص ROMA ، يتم طلاء المواد العضوية في 96 لوحة بئر ، ملطخة بالكالسين ، ويتم تصويرها في مجهر متحد البؤر. يتم قياس الاختلافات المورفولوجية باستخدام مؤشرين: يحدد مؤشر الدائرية (CI) استدارة الكائنات العضوية ، ونسبة الشدة (IR) هي مقياس لوجود تجويف مركزي. تحتوي المواد العضوية غير CF على CI مرتفع ومنخفض IR مقارنة بعضويات CF. ميزت مؤشرات ROMA تماما بين 167 شخصا مصابا بالتليف الكيسي من 22 شخصا بدون التليف الكيسي ، مما يجعل ROMA مقايسة CFTR الفسيولوجية الجذابة للمساعدة في تشخيص التليف الكيسي. يمكن إجراء خزعات المستقيم بشكل روتيني في جميع الأعمار في معظم المستشفيات ويمكن إرسال الأنسجة إلى مختبر مركزي لزراعة الأعضاء وروما. في المستقبل ، يمكن أيضا تطبيق ROMA لاختبار فعالية معدلات CFTR في المختبر. والهدف من هذا التقرير هو تقديم شرح كامل للأساليب المستخدمة في الروما، للسماح بتكرارها في مختبرات أخرى.

تم جمع المواد العضوية من 212 شخصا خلال الزيارات السريرية الروتينية. لم تحدث أي أحداث سلبية أثناء أو بعد إجراء خزعة المستقيم. تم تصوير الكائنات العضوية من قبل أحد الباحثين الذين أعموا عن خصائص الموضوع مثل النمط الجيني والمعلومات السريرية. بسبب الصور منخفضة الجودة ، تم استبعاد 23 موضوعا. يمكن ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

يصف هذا البروتوكول تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA) ، وهو اختبار تشخيصي جديد للتليف الكيسي (CF). الخصائص المورفولوجية ، وهي الاستدارة (مؤشر الدائرية ، CI) ووجود التجويف (نسبة الشدة ، الأشعة تحت الحمراء) ، هي مقياس لوظيفة CFTR. أظهر تحليل 189 شخصا تمييزا تاما بين التليف الكيسي وغير التليف الكيسي.

تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA): اختبار تشخيصي في التليف الكيسي

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

يمكن ل ROMA التمييز بين الكائنات العضوية من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي أو بدونه عندما يتم العثور على أقل من طفرات CFTR المسببة للأمراض وعندما يكون فلوريد العرق متوسطا. يمكن إجراء ROMA في جميع الأعمار وبمعدلات مضاعفات منخفضة. التحليل شبه آلي وموحد ويمكن إرسال الخزعات إلى مختبر مركزي لتحليلها.يمكن أيضا استخدام المواد العضوية المستخدمة في ROMA للوصول إلى فعالية تعديل CFTR ، ويمكن أن تساعد ROMA في قياس درجة استعادة وظيفة CFTR. بعد يوم واحد من الطلاء ، وصمة عار المواد العضوية مع الكالسيوم الأخضر. قم بتدوير اللوحة وإمالتها قليلا مع الغطاء عدة مرات لضمان التوزيع المتجانس للكالسيوم الأخضر في البئر بالكامل.احتضان اللوحة مرة أخرى ، لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لضمان تلطيخ جميع المواد العضوية في الآبار. للتركيز على المواد العضوية ، حدد الموضع الأمثل X و Y ، وركز على الكائنات العضوية في كل بئر يدويا ، باستخدام المجهر متحد البؤر. واحفظ هذه المواضع في برنامج التصوير.بعد ذلك ، باستخدام إعدادات التصوير بالخلايا الحية ، اضبط الانبعاث على 488 نانومتر والإثارة عند 515 نانومتر ، وهدف تكبير LD عند 5X. للحصول على صور عضوية ، التقط صورا بطريقة اتجاهية موحدة بدقة 1024 بكسل × 1024 بكسل ، وعمق 16 بت باستخدام المجهر متحد البؤر. اختر شدة الليزر والكسب الرئيسي للتصور الأمثل للاختلافات المورفولوجية بين التليف الكيسي وعضويات التليف غير الكيسي.ابدأ التجربة لالتقاط الصور. بعد ذلك ، احفظ صورة واحدة لكل بئر لجميع الآبار ال 32 بتنسيق المجهر وقم بتصديرها كملفات TIFF. أولا ، قم بتحميل ملفات TIFF في برنامج تحليل الصور ثم قم بإجراء فحص الجودة الأول بناء على معايير الاستبعاد التي يحددها المشغل.استبعد مجموعة الصور في حالة وجود العديد من الهياكل أو الحطام المتمايز أو الميت عندما تكون كثافة الطلاء غير كافية ، وعند وجود عدد كبير جدا أو قليل جدا من المواد العضوية ، وفي حالة عدم كفاية توزيع التألق. لإعداد الصور للتحليل ، قم بإنشاء وفتح ملف بيانات شبكة واحد لجميع الصور ال 32 لكل ثقافة عضوية ، مما يتيح التحليل المتزامن لجميع الصور ال 32 لكل موضوع. وأعد معايرة الصور بحيث يتوافق بكسل واحد مع 2.5 × 2.5 ميكرومتر.بعد ذلك ، حدد الهياكل باستخدام عتبة كثافة أقل تبلغ 4،500 ، وعتبة عليا تبلغ 65،535 ، وإيقاف تشغيل الوظائف السلسة والنظيفة ، وتشغيل وظيفة فتحات التعبئة ، ووضع الوظيفة المنفصلة عند 3X. لحساب المواد العضوية ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 40 ميكرومتر. بعد ذلك ، انقر فوق زر تحديث قياس ND ، وسيتم ترقيم المواد العضوية المحسوبة.لقياس الكثافة والدائرية للحساب ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 60 ميكرومتر والعد. بعد ذلك ، قم بإزالة جميع الهياكل التي تلامس حدود الصورة. بعد ذلك ، قم بتآكل بكسل واحد من حدود كل منها ، أكثر من أو يساوي 60 ميكرومتر ، وقياس متوسط شدة كل هيكل.بعد ذلك ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 60 ميكرومترا مرة أخرى ، وقم بتآكل 10 بكسل من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بقياس متوسط شدة كل هيكل متآكل ودائرية كل هيكل. بعد ذلك ، احسب نسبة الشدة بقسمة قياس الشدة بعد تآكل 25 ميكرومتر من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر على متوسط قياس الكثافة بعد تآكل 2.5 ميكرومتر من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر.قم بإجراء فحص الجودة الثاني بناء على معايير الاستبعاد التي يحددها البرنامج كما هو موضح في المخطوطة. تم جمع وتصوير المواد العضوية من 212 شخصا. بعد استبعاد 23 مجموعة من الصور ، تم تحليل الصور العضوية من 167 شخصا مصابا بالتليف الكيسي ومرضين يسببان طفرات CFTR ومن 22 شخصا غير مصاب بالتليف الكيسي ، تم العثور على متوسط عدد المواد العضوية لكل مزرعة ليكون 1،519.تم تحديد نسبة الشدة ومؤشر الدائرية للعضويات من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي وبدونه. باستخدام هذين المؤشرين ، تم الحصول على تمييز مثالي بين الكائنات العضوية من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي وبدونه ، ليس فقط عند استخدام البيانات من جميع الآبار ال 32 ، ولكن أيضا عندما تم اختيار ثمانية آبار بشكل عشوائي لكل ثقافة. تم الحصول على الرسوم البيانية لأربع ثقافات توضيحية ، توضح توزيع قيم الدائرية ، وشدة الجزء المركزي من العضو العضوي ، وشدة العضو العضوي بأكمله.تعد مراقبة الجودة أمرا ضروريا ، حيث أن الصور عالية الجودة مطلوبة للحساب الدقيق لنسبة الكثافة ومؤشر الدائرية. يمكن أيضا استخدام الثقافات العضوية التي تم إنشاؤها ل ROMA للمساعدات الفيزيائية لاختبار تأثير علاج CFTR. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين لمزيد من توصيف متغيرات CFTR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

التشخيص بالموجات فوق الصوتية التصوير من ماوس الحجاب الحاجز وظيفة

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

وDimethylnitrosamine المستحثة الكبد تليف النموذجي في الجرذ

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

تحليل شبه الآلي للماوس الهيكل العظمى والعضلات مورفولوجيا وتكوين نوع الألياف

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

أسلوب LC-MS/MS الأمثل لتحليل العينات السريرية إيفاكافتور، والايضات الرئيسية، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية لمرضى التليف الكيسي الفائق

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

قياس موحد لغشاء الآنف ترانسيبيثيليال إمكانات الفرق (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

جيل من الخلايا الظهارية الآنف البشرية الماغنيسيوم فردية التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم الدراسة

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

التحليل الكمي للأشعة المقطعية الصغرى من أورتوباثي في نموذج ماوس β-أمينوبروبيونيتريلي-المستحث الابهر والتشريح

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...