Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Wir danken den Patienten und Eltern, die an dieser Studie teilgenommen haben. Wir danken Abida Bibi für alle Kultivierungsarbeiten mit den Organoiden. Wir danken Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz und Bernard Wenderickx für die logistische Unterstützung. Wir danken auch der Mucovereniging/Association Muco, insbesondere Stefan Joris und Dr. Jan Vanleeuwe, für ihre Unterstützung und Finanzierung. Wir danken allen Mitarbeitern des Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Lüttich, Belgien), Linda Boulanger (Universitätskliniken Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Brüssel, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien), Danny De Looze (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brüssel, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Brüssel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brüssel, Belgien), Monique Lequesne (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien), Stijn Verhulst (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien).

Für alle Eingriffe mit menschlichem Gewebe wurde die Genehmigung durch die Ethikkommission Forschung UZ/KU Leuven (EC Research) eingeholt. Alle Untersuchungen wurden mit informierter Zustimmung und / oder Zustimmung von Eltern, Vertretern und / oder Patienten durchgeführt.
HINWEIS: Alle Verfahren mit rektalen Biopsien und Organoiden sollten in einem laminaren Fluss durchgeführt werden, um den Forscher vor biologischen Gefahren zu schützen und das Risiko einer Kontamination der Kulturen zu ...

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA) zur Verfügung. Die beiden mit ROMA, IR und CI berechneten Indizes unterschieden Organoide von Probanden mit CF von denen ohne CF mit perfekter Genauigkeit. ROMA könnte somit als neuartiger physiologischer CFTR-Assay fungieren, der SCC und andere derzeit verfügbare Testsergänzt 13,14,15.
Das Protokoll ist abh...

Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die durch Mutationen im CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulatorgen (CFTR) verursacht wird. Das CFTR-Protein ist ein Chlorid- und Bikarbonatkanal, der die Hydratation mehrerer Epithelien gewährleistet1. CF ist eine hochbelastete, lebensverkürzende, multisystemische Erkrankung, die sich in erster Linie als Atemwegserkrankung manifestiert, aber auch den Magen-Darm-Trakt, die Bauchspeicheldrüse, die Leber und den Fortpflanzungstrakt betrifft2.
Krankheitsverursachende CFTR-Mutationen führen zu einer Abnahme der Menge oder Funktion von CFTR , was wiederum zu Schleimdehydrierung führt. Mehr als 2.000 Varianten im CFTR-Gen wurden beschrieben3, von denen nur 466 gründlich charakterisiert wurden4.
Eine Diagnose von CF kann gestellt werden, wenn entweder die Schweißchloridkonzentration (SCC) über dem Schwellenwert von 60 mmol/L liegt oder wenn zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen (gemäß der CFTR2-Datenbank) identifiziert werden 4,5. Bei Patienten mit nur mittelstark erhöhtem (30-60 mmol/L) SCC, das bei etwa 4%-5% der Schweißtests auftritt6, und CFTR-Mutationen unterschiedlicher oder unbekannter klinischer Konsequenz kann die Diagnose weder bestätigt noch ausgeschlossen werden, selbst wenn sie CF-kompatible Symptome oder einen positiven neonatalen Screening-Test haben. Für diese Fälle wurden physiologische Second-Line-CFTR-Assays (Nasale Potential Difference (NPD) und Darmstrommessungen (ICM)) in den Diagnosealgorithmus aufgenommen. Diese Tests sind in den meisten Zentren nicht ohne weiteres verfügbar und auch nicht in jedem Alter durchführbar, insbesondere bei Säuglingen5.
Rektale Organoide sind 3D-Strukturen, die aus Lgr5(+) adulten Darmstammzellen aus Darmkrypten gezüchtet werden, die durch Rektalbiopsie gewonnen werden7. Organoide werden zunehmend in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, etwa bei der Testung der Modulatorbehandlung bei CF8. Eine lebensfähige Biopsie kann entweder durch Absaugen oder Zangenbiopsie erreicht werden, ein Verfahren, das nur minimale Beschwerden verursacht und selbst bei Säuglingen mit niedrigen Komplikationsraten sicher ist9. Die aus den rektalen Biopsien isolierten Krypten werden in Stammzellen angereichert, und unter bestimmten Kulturbedingungen organisieren sich diese selbst zu rektalen Organoiden. Die Morphologie dieser Organoide wird durch die Expression und Funktion von CFTR bestimmt, das sich an der apikalen Membran von Epithelzellen befindet. Funktionelle CFTR lässt Chlorid und Wasser in das Organoidlumen eindringen, wodurch eine Quellung von Nicht-CF-Organoiden induziert wird. CF-Organoide quellen nicht an und haben kein sichtbares Lumen10,11.
Die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA) ermöglicht die Unterscheidung zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden basierend auf diesen Unterschieden in der Organoidmorphologie. Nicht-CF-Organoide sind runder und haben ein sichtbares Lumen, während das Gegenteil für CF-Organoide gilt. Für diesen Assay werden patientenspezifische Organoide in 32 Vertiefungen einer 96-Well-Platte plattiert. Nach 1 Tag des Wachstums werden die Organoide mit Calceingrün gefärbt und in einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Die Nicht-CF-Organoide zeigen eine kreisförmigere Form und einen weniger fluoreszierenden zentralen Teil, da das Lumen Flüssigkeit enthält und Calcein nur Zellen färbt. Diese Unterschiede in der Morphologie werden mit zwei ROMA-Indizes quantifiziert: Der Zirkularitätsindex (CI) quantifiziert die Rundheit von Organoiden, während das Intensitätsverhältnis (IR) ein Maß für das Vorhandensein oder Fehlen eines zentralen Lumens ist. In diesem Bericht beschreiben wir detailliert das Protokoll, um diese diskriminativen Indizes zu erhalten, um die Replikation der Technik zu ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

Die Diagnose einer Mukoviszidose (CF) ist nicht immer einfach, insbesondere wenn die Schweißchloridkonzentration intermediär ist und/oder weniger als zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen identifiziert werden können. Physiologische CFTR-Assays (nasale Potentialdifferenz, Darmstrommessung) wurden in den diagnostischen Algorithmus aufgenommen, sind aber nicht immer leicht verfügbar oder durchführbar (z. B. bei Säuglingen). Rektale Organoide sind 3D-Strukturen, die aus Stammzellen wachsen, die aus Krypten einer rektalen Biopsie isoliert wurden, wenn sie unter bestimmten Bedingungen kultiviert werden. Organoide von Nicht-CF-Probanden haben eine runde Form und ein flüssigkeitsgefülltes Lumen, da CFTR-vermittelter Chloridtransport Wasser in das Lumen treibt. Organoide mit defekter CFTR-Funktion quellen nicht an, behalten eine unregelmäßige Form und haben kein sichtbares Lumen. Unterschiede in der Morphologie zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden werden in der 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) als neuartiger CFTR-physiologischer Assay quantifiziert. Für den ROMA-Assay werden Organoide in 96-Well-Platten plattiert, mit Calcein gefärbt und in einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Morphologische Unterschiede werden anhand von zwei Indizes quantifiziert: Der Zirkularitätsindex (CI) quantifiziert die Rundheit von Organoiden, und das Intensitätsverhältnis (IR) ist ein Maß für das Vorhandensein eines zentralen Lumens. Nicht-CF-Organoide haben im Vergleich zu CF-Organoiden ein hohes CI und einen niedrigen IR. ROMA indiziert perfekt 167 Probanden mit CF von 22 Probanden ohne CF, was ROMA zu einem ansprechenden physiologischen CFTR-Assay zur Unterstützung der CF-Diagnose macht. Rektale Biopsien können routinemäßig in jedem Alter in den meisten Krankenhäusern durchgeführt werden, und Gewebe kann an ein zentrales Labor für Organoidkultur und ROMA geschickt werden. In Zukunft könnte ROMA auch angewendet werden, um die Wirksamkeit von CFTR-Modulatoren in vitro zu testen. Das Ziel des vorliegenden Berichts ist es, die für ROMA verwendeten Methoden vollständig zu erklären, um die Replikation in anderen Labors zu ermöglichen.

Organoide von 212 Probanden wurden während routinemäßiger klinischer Besuche gesammelt. Während oder nach der rektalen Biopsie traten keine unerwünschten Ereignisse auf. Organoide wurden von einem Forscher abgebildet, der für Probandenmerkmale wie Genotyp und klinische Informationen blind war. Aufgrund der schlechten Bildqualität wurden 23 Probanden ausgeschlossen. Beispiele für erfolgreiche und gescheiterte Organoidkulturen und Bildaufnahmen sind in Abbildung 2 zu sehen.
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Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Dieses Protokoll beschreibt die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA), einen neuartigen diagnostischen Assay für Mukoviszidose (CF). Morphologische Merkmale, nämlich die Rundheit (Zirkularitätsindex, CI) und das Vorhandensein eines Lumens (Intensitätsverhältnis, IR), sind ein Maß für die CFTR-Funktion. Die Analyse von 189 Probanden zeigte eine perfekte Unterscheidung zwischen CF und Nicht-CF.

Rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA): Ein diagnostischer Assay bei Mukoviszidose

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMA kann zwischen Organoiden von Patienten mit und ohne Mukoviszidose unterscheiden, wenn weniger als zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen gefunden werden und wenn Schweißfluorid intermediär ist. ROMA kann in jedem Alter und mit niedrigen Komplikationsraten durchgeführt werden. Die Analyse erfolgt halbautomatisch und standardisiert und Biopsien können zur Analyse an ein zentrales Labor geschickt werden.Organoide, die für ROMA verwendet werden, können auch verwendet werden, um auf die modulatorische Wirksamkeit von CFTR zuzugreifen, und ROMA könnte bei der Messung des Grades der Wiederherstellung der CFTR-Funktion helfen. Einen Tag nach der Beschichtung färben Sie die Organoide mit Kalziumgrün. Drehen und kippen Sie die Platte mit dem Deckel einige Male, um eine homogene Verteilung des Kalziumgrüns im gesamten Vertiefung zu gewährleisten.Inkubieren Sie die Platte erneut für 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Färbung aller Organoide in den Vertiefungen sicherzustellen. Um auf die Organoide zu fokussieren, bestimmen Sie die optimale X- und Y-Position und fokussieren Sie die Organoide in jeder Vertiefung manuell mit dem konfokalen Mikroskop. Und speichern Sie diese Positionen in der Imaging-Software.Als nächstes stellen Sie mit Live-Cell-Imaging-Einstellungen die Emission auf 488 Nanometer und die Anregung auf 515 Nanometer und ein LD-Vergrößerungsobjektiv auf 5X ein. Um organoide Bilder aufzunehmen, nehmen Sie Bilder in einer Einheitsrichtung mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln und einer Tiefe von 16 Bit mit dem konfokalen Mikroskop auf. Wählen Sie die Laserintensität und die Masterverstärkung für eine optimale Visualisierung morphologischer Unterschiede zwischen Mukoviszidose- und nicht-zystischen Fibrose-Organoiden.Starten Sie das Experiment, um die Bilder aufzunehmen. Speichern Sie anschließend ein Bild pro Vertiefung für alle 32 Vertiefungen im Mikroskopformat und exportieren Sie sie als TIFF-Dateien. Laden Sie zunächst die TIFF-Dateien in die Bildanalysesoftware und führen Sie dann die erste Qualitätsprüfung anhand der vom Bediener festgelegten Ausschlusskriterien durch.Schließen Sie den Satz von Bildern aus, wenn viele differenzierte oder tote Strukturen oder Trümmer vorhanden sind, wenn die Beschichtungsdichte unzureichend ist, wenn zu viele oder zu wenige Organoide vorhanden sind und wenn eine unzureichende Fluoreszenzverteilung vorliegt. Um Bilder für die Analyse vorzubereiten, erstellen und öffnen Sie eine Netzwerkdatendatei aller 32 Bilder für jede Organoidkultur, um die gleichzeitige Analyse aller 32 Bilder pro Subjekt zu ermöglichen. Und kalibrieren Sie Bilder neu, so dass ein Pixel 2,5 mal 2,5 Mikrometer entspricht.Beschreiben Sie dann Strukturen mit einem niedrigeren Intensitätsschwellenwert von 4, 500 und einem oberen Schwellenwert von 65, 535, schalten Sie die glatten und sauberen Funktionen aus, aktivieren Sie die Funktion für Einfülllöcher und setzen Sie die separate Funktion auf 3X. Um die Organoide zu zählen, wählen Sie alle Strukturen aus, die größer oder gleich 40 Mikrometer sind. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche ND-Messung aktualisieren, und die gezählten Organoide werden nummeriert.Um Intensität und Zirkularität für die Berechnung zu messen, wählen Sie alle Strukturen größer oder gleich 60 Mikrometer aus und zählen Sie. Entfernen Sie dann alle Strukturen, die die Ränder des Bildes berühren. Als nächstes erodieren Sie ein Pixel vom Rand jeder Struktur, mehr als oder gleich 60 Mikrometer, und messen Sie die mittlere Intensität jeder Struktur.Wählen Sie anschließend alle Strukturen, die größer oder gleich 60 Mikrometer sind, erneut aus und erodieren Sie 10 Pixel vom Rand jeder Struktur, mehr als oder gleich 60 Mikrometer. Messen Sie dann die mittlere Intensität jeder erodierten Struktur und die Kreisförmigkeit jeder Struktur. Berechnen Sie dann das Intensitätsverhältnis, indem Sie die Intensitätsmessung nach dem Erodieren von 25 Mikrometern vom Rand jeder Struktur um mehr oder gleich 60 Mikrometer durch den Mittelwert der Intensitätsmessung teilen, nachdem 2,5 Mikrometer von der Grenze jeder Struktur erodiert wurden, mehr als oder gleich 60 Mikrometer.Führen Sie die zweite Qualitätsprüfung anhand der von der Software festgelegten Ausschlusskriterien durch, wie im Manuskript beschrieben. Organoide von 212 Probanden wurden gesammelt und abgebildet. Nach Ausschluss von 23 Bildsätzen, Organoidbildern von 167 Probanden mit Mukoviszidose und zwei krankheitserregenden CFTR-Mutationen und von 22 nicht-mukoviszidose-Probanden wurde eine durchschnittliche Anzahl von Organoiden pro Kultur von 1 519 gefunden.Das Intensitätsverhältnis und der Zirkularitätsindex wurden für Organoide von Probanden mit und ohne Mukoviszidose bestimmt. Unter Verwendung dieser beiden Indizes wurde eine perfekte Unterscheidung zwischen Organoiden von Probanden mit und ohne Mukoviszidose erzielt, nicht nur wenn Daten aus allen 32 Vertiefungen verwendet wurden, sondern auch, wenn acht Vertiefungen für jede Kultur zufällig ausgewählt wurden. Es wurden Histogramme für vier illustrative Kulturen erhalten, die die Verteilung der Werte für die Zirkularität, die Intensität des zentralen Teils des Organoids und die Intensität des gesamten Organoids zeigen.Qualitätskontrolle ist unerlässlich, da qualitativ hochwertige Bilder für die genaue Berechnung des Intensitätsverhältnisses und des Zirkularitätsindex erforderlich sind. Organoidkulturen, die für ROMA etabliert wurden, können auch für physikalische Hilfsmittel verwendet werden, um die Wirkung der CFTR-Behandlung zu testen. RNA, DNA und Protein können zur weiteren Charakterisierung von CFTR-Varianten extrahiert werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

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Forschung

Medizin

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Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

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