Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

אנו מודים למטופלים ולהורים שהשתתפו במחקר זה. אנו מודים לאבידה ביבי על כל עבודת התרבות עם האורגנואידים. אנו מודים לאלס ארטגרטס, קרוליין ברוניל, קלייר קולארד, ליליאן קוליניון, מוניק דלפוסה, אניה דלפורטה, נטלי פיירטס, ססיל למברמונט, לוט ניובורג, נטלי פיטרס, אן ראמאן, פים סנסן, הילדה סטיבנס, מריאן שולטה, אלס ואן רנסביק, כריסטל ואן דה ברנדה, ברוך ואן דן איינדה, מרלין ונדרקרקן, אינגה ואן דייק, אודרי וגנר, מוניקה ווסקייביץ' וברנרד ונדריקס על התמיכה הלוגיסטית. אנו מודים גם ל-Mucovereniging/Association Muco, ובמיוחד לסטפן ג'וריס ולד"ר יאן ונליווה, על התמיכה והמימון שלהם. אנו מודים לכל משתפי הפעולה מפרויקט האורגנואיד הבלגי: הדוויג' בובולי (CHR Citadelle, ליאז ', בלגיה), לינדה בולאנז'ה (בתי חולים אוניברסיטאיים לוון, בלגיה), ז'ורז ' קזימיר (HUDERF, בריסל, בלגיה), בנדיקט דה מאייר (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), אלקה דה וכטר (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה), דני דה לוזה (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), איזבל אטיין (CHU Erasme, בריסל, בלגיה), לורנס הנסנס (HUDERF, בריסל), כריסטיאן קנופ (CHU Erasme, בריסל, בלגיה), מוניק לקסנה (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), ויקי נובה (GZA בית החולים סנט וינסנטיוס אנטוורפן), דירק סטאסן (GZA סנט וינסנטיוס בית החולים אנטוורפן), סטפני ואן בירבליט (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), אווה ואן ברקל (בית החולים האוניברסיטאי גנט, בלגיה), קים ואן הורנביק (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), Eef Vanderhelst (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה), Stijn Verhulst (בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן, בלגיה), סטפני וינקן (בית החולים האוניברסיטאי בריסל, בלגיה).

עבור כל ההליכים המערבים רקמה אנושית, נרכש אישור של ועדת האתיקה למחקר UZ/KU Leuven (מחקר EC). כל המחקרים בוצעו בהסכמה מדעת ו/או בהסכמה של הורים, נציגים ו/או מטופלים.
הערה: כל ההליכים הכוללים ביופסיות רקטליות ואורגנואידים צריכים להתבצע בזרימה למינרית כדי להגן על החוקר מפני כל סכנה ביו...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+cystic+fibrosis:+Consensus+guidelines+from+the+cystic+fibrosis+foundation.">Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation.</a> The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).</li><li>Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+variability+of+the+sweat+chloride+in+diagnostic+sweat+tests:+A+retrospective+analysis.">Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).</li><li>Friedmacher, F., Puri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+suction+biopsy+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease:+a+systematic+review+of+diagnostic+accuracy+and+complications.">Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications.</a> Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis.">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA). שני המדדים שחושבו באמצעות ROMA, IR ו-CI, הבדילו בין אורגנואידים לנבדקים עם CF לבין אלה ללא CF בדיוק מושלם. לפיכך, ROMA יכול לתפקד כבדיקת CFTR פיזיולוגית חדשנית המשלימה את SCC ובדיקות אחרות הזמינות כיום13,14,15<sup class="xref...

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה אוטוזומלית רצסיבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR). חלבון CFTR הוא תעלת כלוריד וביקרבונט, המבטיחה הידרציה של מספר אפיתליה1. CF היא מחלה רב-מערכתית בעלת עומס גבוה, מקצרת חיים, המתבטאת בעיקר כמחלה נשימתית, אך משפיעה גם על מערכת העיכול, הלבלב, הכבד ומערכת הרבייה2.
מוטציות CFTR הגורמות למחלות מובילות לירידה בכמות או בתפקוד של CFTR , וכתוצאה מכך גורמות להתייבשות ליחה. יותר מ -2,000 וריאנטים בגן CFTR תוארו3, מתוכם רק 466 אופיינו ביסודיות4.
אבחנה של CF יכולה להיעשות כאשר ריכוז הזיעה הכלוריד (SCC) הוא מעל הסף של 60 mmol / L או כאשר שתי מוטציות CFTR הגורמות למחלה (על פי מסד הנתונים CFTR2) מזוהות 4,5. בנבדקים עם SCC מוגבר בינוני בלבד (30-60 מילימול לליטר), המופיע בכ-4%-5% מבדיקות הזיעה6, ומוטציות CFTR בעלות השלכות קליניות שונות או לא ידועות, לא ניתן לאשר או לשלול את האבחנה, גם כאשר יש להם תסמינים תואמי CF או בדיקת סקר חיובית לילודים. במקרים אלה, מבחני CFTR פיזיולוגיים בקו שני (הפרש פוטנציאל האף (NPD) ומדידות זרם מעיים (ICM)) נכללו באלגוריתם האבחון. בדיקות אלה אינן זמינות ברוב המרכזים ואינן ניתנות לביצוע בכל הגילאים, במיוחד בתינוקות5.
אורגנואידים רקטליים הם מבנים תלת-ממדיים הגדלים מתאי גזע של מעי בוגרים Lgr5(+) מקריפטות מעיים המתקבלות באמצעות ביופסיה רקטלית7. אורגנואידים נמצאים בשימוש הולך וגובר במחקר ביו-רפואי, כגון בדיקת טיפול במודולטור ב-CF8. ביופסיה בת קיימא ניתן להשיג על ידי יניקה או ביופסיה מלקחיים, הליך שגורם רק אי נוחות מינימלית והוא בטוח גם בתינוקות, עם שיעורי סיבוכים נמוכים9. הקריפטות שבודדו מהביופסיות הרקטליות מועשרות בתאי גזע, ובתנאי גידול ספציפיים, אלה מתארגנים בעצמם לאורגנואידים רקטליים. המורפולוגיה של אורגנואידים אלה נקבעת על ידי הביטוי והתפקוד של CFTR, הממוקם בקרום האפיקלי של תאי אפיתל. CFTR פונקציונלי מאפשר לכלוריד ולמים להיכנס לומן האורגנואידים, ובכך לגרום לנפיחות של אורגנואידים שאינם CF. אורגנואידים של CF אינם מתנפחים ואין להם לומן נראה לעין10,11.
ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA) מאפשר הבחנה בין אורגנואידים CF לאורגנואידים שאינם CF בהתבסס על הבדלים אלה במורפולוגיה האורגנואידית. אורגנואידים שאינם CF הם עגולים יותר ויש להם לומן נראה לעין, בעוד שההפך הוא הנכון עבור אורגנואידים CF. לצורך בדיקה זו, אורגנואידים ספציפיים למטופל מצופים ב -32 בארות של צלחת 96 באר. לאחר יום אחד של גידול, האורגנואידים מוכתמים בירוק קלצ'ין ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. האורגנואידים שאינם CF מראים צורה מעגלית יותר וחלק מרכזי פחות פלואורסצנטי, שכן לומן מכיל כתמי נוזל וקלצין בלבד. הבדלים אלה במורפולוגיה מכמתים באמצעות שני מדדי ROMA: מדד המעגליות (CI) מכמת את העגולות של האורגנואידים, ואילו יחס העוצמה (IR) הוא מדד לנוכחות או היעדרות של לומן מרכזי. בדוח זה אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לקבלת אינדקסים מפלים אלה, כדי לאפשר שכפול של הטכניקה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

אבחון של סיסטיק פיברוזיס (CF) אינו תמיד פשוט, במיוחד כאשר ריכוז הזיעה הכלוריד הוא בינוני ו/או פחות משתי מוטציות CFTR הגורמות למחלות. מבחני CFTR פיזיולוגיים (הפרש פוטנציאלים באף, מדידת זרם מעיים) נכללו באלגוריתם האבחון אך לא תמיד זמינים או אפשריים (למשל, בתינוקות). אורגנואידים רקטליים הם מבנים תלת-ממדיים שגדלים מתאי גזע שבודדו מקריפטות של ביופסיה רקטלית כאשר הם מתורבתים בתנאים מסוימים. לאורגנואידים מנבדקים שאינם CF יש צורה עגולה ולומן מלא בנוזל, שכן הובלת כלוריד בתיווך CFTR מניעה מים לתוך לומן. אורגנואידים עם פונקציית CFTR פגומה אינם מתנפחים, שומרים על צורה לא סדירה ואין להם לומן נראה לעין. הבדלים במורפולוגיה בין אורגנואידים מסוג CF לבין אורגנואידים שאינם CF מכמתים ב'ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית' (ROMA) כבדיקה פיזיולוגית חדשנית של CFTR. עבור מבחן ROMA, אורגנואידים מצופים בלוחות 96 באר, מוכתמים בקלצין, ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. הבדלים מורפולוגיים מכמתים באמצעות שני מדדים: מדד המעגליות (CI) מכמת את העגולות של האורגנואידים, ויחס העוצמה (IR) הוא מדד לנוכחות לומן מרכזי. לאורגנואידים שאינם CF יש CI גבוה ו-IR נמוך בהשוואה לאורגנואידים של CF. מדדי ROMA מפלים באופן מושלם 167 נבדקים עם CF מ-22 נבדקים ללא CF, מה שהופך את ROMA לבדיקת CFTR פיזיולוגית מושכת המסייעת באבחון CF. ביופסיות רקטליות יכולות להתבצע באופן שגרתי בכל הגילאים ברוב בתי החולים וניתן לשלוח רקמות למעבדה מרכזית לתרבית אורגנואידית ו-ROMA. בעתיד, ROMA עשוי להיות מיושם גם כדי לבחון את היעילות של מודולטורים CFTR במבחנה. מטרת הדו"ח הנוכחי היא להסביר באופן מלא את השיטות המשמשות את ROMA, כדי לאפשר שכפול במעבדות אחרות.

אורגנואידים מ-212 נבדקים נאספו במהלך ביקורים קליניים שגרתיים. לא התרחשו תופעות לוואי במהלך או לאחר הליך הביופסיה הרקטלית. אורגנואידים צולמו על ידי חוקר אחד עיוור למאפייני הנושא כגון גנוטיפ ומידע קליני. בשל תמונות באיכות נמוכה, 23 נושאים לא נכללו. דוגמאות לתרביות אורגנואידיות מוצלחות וכושלו...

Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

פרוטוקול זה מתאר ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA), בדיקה אבחנתית חדשנית לסיסטיק פיברוזיס (CF). מאפיינים מורפולוגיים, כלומר המעוגלות (מדד מעגליות, CI) ונוכחות לומן (יחס עוצמה, IR), הם מדד לפונקציית CFTR. ניתוח של 189 נבדקים הראה אפליה מושלמת בין CF ללא CF.

ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA): בדיקה אבחנתית בסיסטיק פיברוזיס

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMA יכול להבחין בין אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס כאשר נמצאות פחות משתי מוטציות CFTR הגורמות למחלה וכאשר פלואוריד הזיעה הוא בינוני. ניתן לבצע ROMA בכל הגילאים ובשיעורי סיבוכים נמוכים. הניתוח הוא חצי אוטומטי וסטנדרטי וניתן לשלוח ביופסיות למעבדה מרכזית לניתוח.ניתן להשתמש באורגנואידים המשמשים ל-ROMA גם כדי לגשת ליעילות אפנון CFTR, ו-ROMA יכול לסייע במדידת מידת השיקום של פונקציית CFTR. יום לאחר הציפוי, מכתימים את האורגנואידים בירוק סידן. סובבו והטו מעט את הצלחת עם המכסה כמה פעמים כדי להבטיח פיזור הומוגני של ירוק הסידן בבאר כולה.דגרו שוב את הצלחת, למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי להבטיח צביעה של כל האורגנואידים בבארות. כדי להתמקד באורגנואידים, לקבוע את המיקום האופטימלי X ו- Y, ולהתמקד באורגנואידים בכל באר באופן ידני, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ולשמור את המיקומים האלה בתוכנת ההדמיה.לאחר מכן, באמצעות הגדרות הדמיה של תאים חיים, הגדר את הפליטה על 488 ננומטר ואת העירור על 515 ננומטר, ואת יעד הגדלת LD על 5X. כדי לרכוש תמונות אורגנואידיות, צלם תמונות בצורה כיוונית יחידה ברזולוציה של 1024 פיקסלים על 1024 פיקסלים, ועומק של 16 סיביות עם המיקרוסקופ הקונפוקלי. בחר את עוצמת הלייזר ואת רווח האב להדמיה אופטימלית של הבדלים מורפולוגיים בין סיסטיק פיברוזיס לבין אורגנואידים שאינם סיסטיק פיברוזיס.התחל את הניסוי כדי ללכוד את התמונות. לאחר מכן, שמור תמונה אחת לכל באר עבור כל 32 הבארות בפורמט מיקרוסקופ וייצא אותן כקבצי TIFF. ראשית, טען את קבצי TIFF בתוכנת ניתוח התמונה ולאחר מכן בצע את בדיקת האיכות הראשונה בהתבסס על קריטריוני אי הכללה שנקבעו על ידי המפעיל.אל תכלול את קבוצת התמונות אם קיימים מבנים או פסולת מובחנים או מתים רבים כאשר צפיפות הציפוי אינה מספקת, כאשר קיימים יותר מדי אורגנואידים או מעט מדי, ובמקרה של התפלגות פלואורסצנטית לא מספקת. כדי להכין תמונות לניתוח, צור ופתח קובץ נתוני רשת אחד של כל 32 התמונות עבור כל תרבות אורגנואידית, המאפשר ניתוח סימולטני של כל 32 התמונות לכל נושא. וכייל מחדש תמונות כך שפיקסל אחד יתאים ל-2.5 על 2.5 מיקרומטר.לאחר מכן, תיחום מבנים באמצעות סף עוצמה נמוך יותר של 4, 500, וסף עליון של 65, 535, כיבוי הפונקציות החלקות והנקיות, הפעלת פונקציית חורי המילוי, והצבת הפונקציה הנפרדת על פי 3. כדי לספור את האורגנואידים, בחר את כל המבנים יותר או שווה ל 40 מיקרומטר. לאחר מכן, לחץ על כפתור המדידה עדכן ND, והאורגנואידים שנספרו יהיו ממוספרים.כדי למדוד עוצמה ומעגליות לחישוב, בחר את כל המבנים הגדולים או שווים ל- 60 מיקרומטר וספור. לאחר מכן, הסר את כל המבנים הנוגעים בגבולות התמונה. לאחר מכן, יש לשחוק פיקסל אחד מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר, ולמדוד את העוצמה הממוצעת של כל מבנה.לאחר מכן, בחר שוב את כל המבנים הגדולים או שווים ל- 60 מיקרומטר, ושחק 10 פיקסלים מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה ל- 60 מיקרומטר. לאחר מכן, מדוד את העוצמה הממוצעת של כל מבנה שנשחק ואת המעגליות של כל מבנה. לאחר מכן, חשב את יחס העוצמה על ידי חלוקת מדידת העוצמה לאחר שחיקה של 25 מיקרומטר מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר בממוצע של מדידת העוצמה לאחר שחיקה של 2.5 מיקרומטר מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר.בצע את בדיקת האיכות השנייה בהתבסס על קריטריוני אי-הכללה שנקבעו על-ידי התוכנה כמתואר בכתב היד. אורגנואידים מ-212 נבדקים נאספו וצולמו. לאחר הרחקה של 23 סטים של תמונות, תמונות אורגנואידיות מ-167 נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס ושתי מחלות הגורמות למוטציות CFTR ומ-22 נבדקים שאינם סיסטיק פיברוזיס, נמצא כי המספר הממוצע של אורגנואידים לכל תרבית הוא 1, 519.יחס העוצמה ומדד המעגליות נקבעו עבור אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס. באמצעות שני מדדים אלה, התקבלה הבחנה מושלמת בין אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס לא רק בעת שימוש בנתונים מכל 32 הבארות, אלא גם כאשר שמונה בארות נבחרו באקראי לכל תרבית. התקבלו היסטוגרמות לארבע תרביות אילוסטרציה, המציגות את התפלגות הערכים למעגליות, את עוצמת החלק המרכזי של האורגנואיד ואת עוצמת האורגנואיד כולו.בקרת איכות היא חיונית, שכן תמונות באיכות גבוהה נדרשות לחישוב מדויק של יחס העוצמה ומדד המעגליות. תרביות אורגנואידיות שהוקמו עבור ROMA יכולות לשמש גם כעזרים פיזיקליים כדי לבחון את ההשפעה של טיפול ב-CFTR. ניתן להפיק RNA, DNA וחלבון לצורך אפיון נוסף של גרסאות CFTR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

אולטראסאונד הדמיה לאבחון של תפקוד העכבר דיאפרגמה

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

מודל הפיברוזיס Dimethylnitrosamine מושרה בחולדה

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

מדידה מתוקננת של ההבדל Transepithelial פוטנציאל ממברנה האף (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...