Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
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この研究に参加した患者と保護者に感謝します。オルガノイドを使ったすべての培養作業について、アビダビビに感謝します。エルス・アールトゲルツ、カロリアン・ブルニール、クレア・コラード、リリアン・コリニョン、モニーク・デルフォス、アニヤ・デルポルト、ナタリー・フェイヤールツ、セシル・ランブルモン、ルート・ニューボルグ、ナタリー・ピーターズ、アン・ラマン、ピム・サンセン、ヒルデ・スティーブンス、マリアンヌ・シュルテ、エルス・ヴァン・ランズビーク、クリステル・ヴァン・デ・ブランデ、グリート・ヴァン・デン・アインデ、マーリーン・ヴァンデルケルケン、インゲ・ヴァン・ダイク、オードリー・ワグネル、モニカ・ワスキエヴィッチ、バーナード・ウェンデリックスの後方支援に感謝します。また、Mucovereniging/Association Muco、特にStefan JorisとJan Vanleeuwe博士の支援と資金提供にも感謝します。ヘドウィゲ・ボボリ(CHRシタデル、リエージュ、ベルギー)、リンダ・ブーランジェ(ベルギー、ルーヴェン大学病院)、ジョルジュ・カシミール(HUDERF、ブリュッセル、ベルギー)、ベネディクト・デ・マイエール(ゲント大学病院、ベルギー)、エルケ・デ・ワクター(ベルギー、ブリュッセル大学病院)、ダニー・デ・ルーズ(ゲント大学病院、ベルギー)、イザベル・エティエンヌ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベルギー)、ローレンス・ハンセンス(HUDERF、 ブリュッセル)、クリスティアーネ・クヌープ(CHUエラスム、ブリュッセル、ベルギー)、モニーク・ルケイン(アントワープ大学病院、ベルギー)、ヴィッキー・ノウェ(GZAセントビンセンティウス病院アントワープ)、ディルク・シュテッセン(GZAセントビンセンティウス病院アントワープ)、ステファニー・ヴァン・ビアヴリート(ゲント大学病院、ベルギー)、エヴァ・ヴァン・ブレーケル(ゲント大学病院、ベルギー)、キム・ファン・ホーレンベック(アントワープ大学病院、ベルギー)、イーフ・ヴァンダーヘルスト(ブリュッセル大学病院、ベルギー)、スティン・フェルフルスト(アントワープ大学病院、 ベルギー)、ステファニーヴィンケン(ベルギー、ブリュッセル大学病院)。

ヒト組織に関わるすべての手順について、倫理委員会研究UZ/KUルーヴェン(EC研究)の承認を取得しました。すべての研究は、親、代表者、および/または患者からのインフォームドコンセントおよび/または同意を得て実施されました。
注:直腸生検およびオルガノイドを含むすべての手順は、研究者を生物学的危険から保護し、培養物の汚染のリスクを最小限に抑えるため?...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

直腸オルガノイド形態解析(ROMA)のための詳細なプロトコルを提供します。ROMA、IR、およびCIで計算された2つの指標は、CFのある被験者とCFのない被験者のオルガノイドを完全な精度で区別しました。したがって、ROMAは、SCCおよび他の現在利用可能な試験を補完する新しい生理学的CFTRアッセイとして機能する可能性がある13、14、<sup class="xref"...

嚢胞性線維症(CF)は、CF膜貫通コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患です。CFTRタンパク質は塩化物および重炭酸塩チャネルであり、いくつかの上皮1の水和を確実にする。CFは、主に呼吸器疾患として現れるだけでなく、胃腸管、膵臓、肝臓、および生殖管にも影響を与える、高負荷で寿命を縮める多系統疾患です2。
病気の原因となるCFTR変異は、 CFTR の量または機能の低下につながり、粘液脱水を引き起こします。 CFTR 遺伝子には2,000を超える変異体が記載されており3、そのうち466のみが完全に特徴付けられています4。
CFの診断は、汗塩化物濃度(SCC)が60 mmol / Lのしきい値を超えている場合、または2つの疾患の原因となるCFTR変異(CFTR2データベースによる)が特定された場合に行うことができます4,5。汗検査の約4%〜5%で発生する中程度に上昇した(30〜60 mmol / L)SCCのみの被験者6、およびさまざまなまたは未知の臨床的結果のCFTR変異では、CF互換の症状または新生児スクリーニング検査が陽性であっても、診断を確認または除外することはできません。これらの場合、セカンドラインの生理学的CFTRアッセイ(鼻電位差(NPD)および腸電流測定(ICM))が診断アルゴリズムに含まれています。これらの検査は、ほとんどのセンターで容易に利用できるわけではなく、すべての年齢、特に乳児5で実施可能ではありません。
直腸オルガノイドは、直腸生検7によって得られた腸陰窩からのLgr5(+)成体腸幹細胞から増殖した3D構造です。オルガノイドは、CF8でのモジュレーター治療のテストなど、生物医学研究でますます使用されています。実行可能な生検は、吸引生検または鉗子生検のいずれかによって得ることができ、不快感を最小限に抑え、乳児でも安全で、合併症の発生率は低い9。直腸生検から単離された陰窩は幹細胞に富み、特定の培養条件下では、これらは直腸オルガノイドに自己組織化します。これらのオルガノイドの形態は、上皮細胞の頂端膜に位置するCFTRの発現および機能によって決定される。機能的なCFTRは、塩化物と水がオルガノイド内腔に入ることを可能にし、それによって非CFオルガノイドの膨潤を誘発します。CFオルガノイドは膨潤せず、目に見える内腔を持たない10,11。
直腸オルガノイド形態解析(ROMA)は、オルガノイド形態におけるこれらの違いに基づいて、CFオルガノイドと非CFオルガノイドを区別することを可能にする。非CFオルガノイドはより丸く、目に見える内腔を有するが、CFオルガノイドはその逆である。このアッセイでは、患者特異的オルガノイドを96ウェルプレートの32ウェルにプレーティングします。成長の1日後、オルガノイドをカルセイングリーンで染色し、共焦点顕微鏡で画像化します。非CFオルガノイドは、内腔に液体が含まれ、カルセインが細胞のみを染色するため、より円形で蛍光性の低い中央部を示します。これらの形態の違いは、2つのROMAインデックスを使用して定量化されます:円形度インデックス(CI)はオルガノイドの真円度を定量化し、強度比(IR)は中心内腔の有無の尺度です。本報告では、これらの識別指標を取得し、技術の複製を可能にするためのプロトコルについて詳細に説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

嚢胞性線維症(CF)の診断は、特に汗の塩化物濃度が中程度である場合、および/または2つ未満の疾患の原因となる CFTR 変異を特定できる場合、必ずしも簡単ではありません。生理学的CFTRアッセイ(鼻電位差、腸電流測定)は診断アルゴリズムに含まれていますが、必ずしも容易に利用可能または実行可能であるとは限りません(例:乳児)。直腸オルガノイドは、特定の条件下で培養した場合に直腸生検の陰窩から分離された幹細胞から成長する3D構造です。非CF被験者からのオルガノイドは、CFTRを介した塩化物輸送が水を内腔に送り込むため、丸い形状と液体で満たされた内腔を有する。CFTR機能に欠陥のあるオルガノイドは膨潤せず、不規則な形状を保ち、目に見える内腔を持たない。CFオルガノイドと非CFオルガノイドの形態の違いは、新しいCFTR生理学的アッセイとして「直腸オルガノイド形態分析」(ROMA)で定量化されています。ROMAアッセイでは、オルガノイドを96ウェルプレートにプレーティングし、カルセインで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングします。形態学的差異は、2つの指標を使用して定量化されます:円形度指数(CI)はオルガノイドの真円度を定量化し、強度比(IR)は中心内腔の存在の尺度です。非CFオルガノイドは、CFオルガノイドと比較してCIが高く、IRが低い。ROMAインデックスは、CFの167人の被験者とCFのない22人の被験者を完全に区別し、ROMAをCF診断に役立つ魅力的な生理学的CFTRアッセイにしました。直腸生検は、ほとんどの病院ですべての年齢層で日常的に行うことができ、組織はオルガノイド培養とROMAのために中央研究所に送ることができます。将来的には、ROMAはCFTRモジュレーターの有効性を in vitroで試験するためにも適用される可能性があります。本レポートの目的は、ROMAに使用される方法を完全に説明し、他のラボでの複製を可能にすることです。

212人の被験者からのオルガノイドは、定期的な臨床訪問中に収集されました。直腸生検処置中または直腸生検後に有害事象は発生しなかった。オルガノイドは、遺伝子型や臨床情報などの被験者の特徴を知らされていない1人の研究者によって画像化されました。画像の品質が低いため、23人の被験者が除外されました。オルガノイド培養と画像取得の成功例と失敗例を 図2</str...

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Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

このプロトコルは、嚢胞性線維症(CF)の新しい診断アッセイである直腸オルガノイド形態分析(ROMA)について説明しています。形態学的特徴、すなわち真円度(円形度指数、CI)および内腔の存在(強度比、IR)は、CFTR機能の尺度である。189人の被験者の分析は、CFと非CFの間の完全な識別を示しました。

直腸オルガノイド形態分析(ROMA):嚢胞性線維症の診断アッセイ

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMAは、嚢胞性線維症のある被験者とない被験者のオルガノイドを、病気の原因となるCFTR変異が2つ未満しか見られない場合、および汗のフッ化物が中間である場合に区別できます。ROMAは、すべての年齢層で、合併症の発生率が低い状態で実行できます。分析は半自動化され標準化されており、生検は分析のために中央研究所に送ることができます。ROMAに使用されるオルガノイドは、CFTR調節効果にアクセスするためにも使用でき、ROMAはCFTR機能の回復度の測定に役立つ可能性があります。メッキの1日後、オルガノイドをカルシウムグリーンで染色します。蓋をした状態でプレートを数回回転させてわずかに傾け、ウェル全体でカルシウムグリーンが均一に分布するようにします。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で15〜30分間インキュベートして、ウェル内のすべてのオルガノイドを確実に染色します。オルガノイドに焦点を合わせるには、最適なX位置とY位置を決定し、共焦点顕微鏡を使用して各ウェルのオルガノイドに手動で焦点を合わせます。そして、これらの位置をイメージングソフトウェアに保存します。次に、ライブセルイメージング設定を使用して、発光を488ナノメートル、励起を515ナノメートルに設定し、LD倍率対物レンズを5倍に設定します。オルガノイド画像を取得するには、共焦点顕微鏡で解像度1024ピクセル×1024ピクセル、深度16ビットの単位指向性で画像を撮影します。レーザー強度とマスターゲインを選択して、嚢胞性線維症と非嚢胞性線維症オルガノイドの形態学的差異を最適に視覚化します。実験を開始して画像をキャプチャします。その後、32ウェルすべてのウェルごとに1枚の画像を顕微鏡形式で保存し、TIFFファイルとしてエクスポートします。まず、TIFFファイルを画像解析ソフトウェアにロードしてから、オペレーターが決定した除外基準に基づいて最初の品質チェックを実行します。めっき密度が不十分な場合、オルガノイドが多すぎるか少なすぎる場合、および蛍光分布が不十分な場合に、分化または死んだ構造または破片が多数存在する場合は、一連の写真を除外します。解析用の画像を準備するには、オルガノイド培養ごとに全32枚の画像からなるネットワークデータファイルを1つ作成して開き、被験者ごとに32枚の画像すべてを同時に解析できるようにします。また、1ピクセルが2.5 x 2.5マイクロメートルに対応するように画像を再調整します。次に、強度の下限しきい値4, 500、上限しきい値65, 535を使用して構造を描き、スムーズでクリーンな機能をオフにし、穴埋め機能をオンにし、分離機能を3倍にします。オルガノイドをカウントするには、40マイクロメートル以上のすべての構造を選択します。次に、ND測定の更新ボタンをクリックすると、カウントされたオルガノイドに番号が付けられます。計算のために強度と真円度を測定するには、60マイクロメートル以上のすべての構造を選択してカウントします。次に、画像の境界線に接しているすべての構造を削除します。次に、60マイクロメートル以上の構造体の境界から1画素侵食し、各構造体の平均強度を測定する。その後、60マイクロメートル以上のすべての構造体を再度選択し、60マイクロメートル以上の構造体の境界から10ピクセル侵食します。次に、侵食された各構造の平均強度と各構造の円形度を測定します。そして、各々の境界から25マイクロメートル侵食した後の強度測定値を、各々の境界から2.5マイクロメートル侵食した後の強度測定値の平均で除して強度比を算出し、60マイクロメートル以上、60マイクロメートル以上の構造体とする。原稿に記載されているように、ソフトウェアによって決定された除外基準に基づいて2番目の品質チェックを実行します。212人の被験者からオルガノイドを収集し、画像化した。23セットの写真を除外した後、嚢胞性線維症およびCFTR変異を引き起こす2つの疾患を有する167人の被験者からのオルガノイド画像、および22人の非嚢胞性線維症被験者から分析したところ、培養物あたりのオルガノイドの平均数は1,519であることがわかった。強度比および円形度指数は、嚢胞性線維症の有無にかかわらず被験者からのオルガノイドについて決定された。これら2つの指標を用いて、嚢胞性線維症を有する被験者と有しない被験者のオルガノイド間の完全な識別は、32ウェルすべてのデータを使用した場合だけでなく、各培養物に対して8つのウェルをランダムに選択した場合にも得られた。円形度の値の分布、オルガノイドの中央部分の強度、およびオルガノイド全体の強度を示す4つの例示的培養のヒストグラムが得られました。強度比と円形度指数を正確に計算するには高品質の画像が必要となるため、品質管理は不可欠です。ROMA用に確立されたオルガノイド培養は、CFTR処理の効果をテストするための物理補助にも使用できます。RNA、DNA、およびタンパク質を抽出して、CFTR変異体のさらなる特性評価を行うことができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

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ラットにおけるジメチルニトロソアミン誘発性肝線維症モデル

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Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

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