Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

이 연구에 참여한 환자와 부모에게 감사드립니다. 우리는 오가노이드를 사용한 모든 배양 작업에 대해 Abida Bibi에게 감사드립니다. 엘스 에어트게르츠, 카롤리엔 브루닐, 클레어 콜라드, 릴리안 콜리뇽, 모니크 델포세, 안야 델포르테, 나탈리 페야르츠, 세실 람브레몽, 루트 니우보르그, 나탈리 피터스, 앤 라만, 핌 산센, 힐데 스티븐스, 마리안 슐테, 엘스 반 란스비크, 크리스텔 반 데 브랜드, 그리트 반 덴 아인데, 마를린 반데커켄, 잉게 반 다이크, 오드리 바게너, 모니카 와스키에비츠, 버나드 벤데릭스에게 물류 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 Mucovereniging / Association Muco, 특히 Stefan Joris와 Jan Vanleeuwe 박사의 지원과 자금 지원에 감사드립니다. Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, 벨기에), Linda Boulanger (벨기에 루벤 대학 병원), Georges Casimir (HUDERF, 브뤼셀, 벨기에), Benedicte De Meyere (벨기에 겐트 대학 병원), Elke de Wachter (벨기에 브뤼셀 대학 병원), Danny De Looze (벨기에 겐트 대학 병원), Isabelle Etienne (CHU Erasme, 브뤼셀, 벨기에), Laurence Hanssens (HUDERF, 브뤼셀), 크리스티안 크눕 (CHU 에라스메, 브뤼셀, 벨기에), 모니크 르케스네 (벨기에 앤트워프 대학 병원), 비키 노베 (앤트워프 세인트 빈센티우스 병원 GZA), 더크 슈테센 (GZA 세인트 빈센티우스 병원 앤트워프), 스테파니 반 비에르블리에 (벨기에 겐트 대학 병원), 에바 반 브라켈 (벨기에 겐트 대학 병원), 킴 반 후렌비크 (벨기에 앤트워프 대학 병원), 에프 반데르헬스트 (벨기에 브뤼셀 대학 병원), Stijn Verhulst (앤트워프 대학 병원, 벨기에), 스테파니 빈켄 (벨기에 브뤼셀 대학 병원).

인체 조직과 관련된 모든 절차에 대해 윤리위원회 연구 UZ/KU Leuven(EC 연구)의 승인을 획득했습니다. 모든 연구는 부모, 대리인 및/또는 환자의 사전 동의 및/또는 동의를 받아 수행되었습니다.
알림: 직장 생검 및 오가노이드와 관련된 모든 절차는 생물학적 위험으로부터 연구원을 보호하고 배양 물의 오염 위험을 최소화하기 위해 층류로 수행되어야 합니다. 모든 실험실 절차?...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+cystic+fibrosis:+Consensus+guidelines+from+the+cystic+fibrosis+foundation.">Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation.</a> The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).</li><li>Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+variability+of+the+sweat+chloride+in+diagnostic+sweat+tests:+A+retrospective+analysis.">Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).</li><li>Friedmacher, F., Puri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+suction+biopsy+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease:+a+systematic+review+of+diagnostic+accuracy+and+complications.">Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications.</a> Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis.">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

우리는 직장 오가노이드 형태 분석 (ROMA)을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. ROMA, IR 및 CI로 계산된 두 지수는 CF가 있는 피험자와 CF가 없는 피험자의 오가노이드를 완벽한 정확도로 구별했습니다. 따라서, ROMA는 SCC 및 다른 현재 이용 가능한 시험13,14,15를 보완하는 새로운 생리학적 CFTR 분석으로서 기능할 수 있다.
<p class="...

낭포성 섬유증(CF)은 CF 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 질환입니다. CFTR 단백질은 염화물 및 중탄산염 채널로 여러 상피1의 수화를 보장합니다. CF는 주로 호흡기 질환으로 나타나지만 위장관, 췌장, 간 및 생식 기관에도 영향을 미치는 고부담, 수명 단축, 다중 시스템 질환입니다2.
질병을 유발하는 CFTR 돌연변이는 CFTR의 양이나 기능을 감소시켜 점액 탈수를 유발합니다. CFTR 유전자의 2,000개 이상의 변이체가 기술되었으며3, 그 중 466개만이 완전히 특성화되었습니다4.
CF의 진단은 땀 염화물 농도 (SCC)가 60 mmol / L의 임계 값을 초과하거나 두 가지 질병 유발 CFTR 돌연변이 (CFTR2 데이터베이스에 따름)가 확인 될 때 4,5 할 수 있습니다. 땀 검사의 약 4%-5%에서 발생하는 중간 상승(30-60mmol/L) SCC만 있는 피험자6와 다양하거나 알려지지 않은 임상적 결과의 CFTR 돌연변이가 있는 피험자의 경우 CF 호환 증상이 있거나 신생아선별 검사에서 양성인 경우에도 진단을 확인하거나 배제할 수 없습니다. 이러한 경우 2차 생리학적 CFTR 분석(비강 전위차(NPD) 및 장 전류 측정(ICM))이 진단 알고리즘에 포함되었습니다. 이러한 검사는 대부분의 센터에서 쉽게 이용할 수 없으며 모든 연령대, 특히 유아에서 가능합니다5.
직장 오가노이드는 직장 생검을 통해 얻은 장자루에서 Lgr5(+) 성체 장 줄기 세포에서 성장한 3D 구조입니다7. 오가노이드는 CF8에서 변조기 처리 테스트와 같은 생물 의학 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 생존 가능한 생검은 흡입 또는 겸자 생검으로 얻을 수 있으며, 이는 최소한의 불편 함을 유발하고 유아에서도 안전하며 합병증 비율이 낮습니다9. 직장 생검에서 분리 된 음와에는 줄기 세포가 풍부하며 특정 배양 조건에서 이들은 직장 오가노이드로 자체 구성됩니다. 이 유기체의 형태는 상피 세포의 정점 막에 위치한 CFTR의 발현과 기능에 의해 결정됩니다. 기능성 CFTR은 염화물과 물이 오가노이드 내강으로 들어가도록 하여 비-CF 오가노이드의 팽창을 유도합니다. CF 유기체는 팽창하지 않으며 눈에 보이는 루멘이 없습니다10,11.
직장 오가노이드 형태 분석(ROMA)은 이러한 오가노이드 형태의 차이를 기반으로 CF와 비-CF 오가노이드를 구별할 수 있습니다. 비 CF 오가노이드는 더 둥글고 눈에 보이는 루멘을 갖는 반면, CF 오가노이드의 경우 그 반대입니다. 이 분석을 위해 환자 특이적 오가노이드를 96웰 플레이트의 32개 웰에 플레이팅합니다. 성장 1일 후, 오가노이드는 칼세인 그린으로 염색되고 컨포칼 현미경으로 이미지화됩니다. 비 CF 오가노이드는 내강에 유체가 포함되어 있고 칼세인이 세포만 염색하기 때문에 더 원형이고 덜 형광적인 중앙 부분을 보여줍니다. 이러한 형태의 차이는 두 개의 ROMA 지수를 사용하여 정량화됩니다 : 원형도 지수 (CI)는 유기체의 진원도를 정량화하는 반면, 강도비 (IR)는 중심 루멘의 유무를 측정 한 것입니다. 이 보고서에서는 기술의 복제를 허용하기 위해 이러한 차별적 지수를 얻는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

낭포성 섬유증(CF)의 진단은 항상 간단한 것은 아니며, 특히 땀 염화물 농도가 중간이거나 질병을 유발하는 CFTR 돌연변이가 2개 미만인 경우 더욱 그렇습니다. 생리학적 CFTR 분석(비강 전위차, 장 전류 측정)이 진단 알고리즘에 포함되었지만 항상 쉽게 이용 가능하거나 실현 가능한 것은 아닙니다(예: 유아에서). 직장 오가노이드는 특정 조건에서 배양할 때 직장 생검의 음와에서 분리된 줄기 세포에서 자라는 3D 구조입니다. 비 CF 피험자의 유기체는 CFTR 매개 염화물 수송이 물을 내강으로 유도하기 때문에 둥근 모양과 유체로 채워진 내강을 가지고 있습니다. CFTR 기능에 결함이있는 유기체는 팽창하지 않고 불규칙한 모양을 유지하고 눈에 보이는 루멘이 없습니다. CF와 비 CF 오가노이드 간의 형태 차이는 새로운 CFTR 생리학적 분석으로 '직장 오가노이드 형태 분석'(ROMA)에서 정량화됩니다. ROMA 분석을 위해 오가노이드를 96웰 플레이트에 플레이팅하고 칼세인으로 염색한 다음 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 형태 학적 차이는 두 가지 지수를 사용하여 정량화됩니다 : 원형도 지수 (CI)는 유기체의 진원도를 정량화하고 강도비 (IR)는 중심 루멘의 존재를 측정 한 것입니다. 비 CF 오가노이드는 CF 오가노이드에 비해 높은 CI와 낮은 IR을 갖는다. ROMA 지수는 CF가 없는 22명의 피험자와 CF가 있는 167명의 피험자를 완벽하게 구별하여 ROMA를 CF 진단에 도움이 되는 매력적인 생리학적 CFTR 분석법으로 만들었습니다. 직장 생검은 대부분의 병원에서 모든 연령대에서 일상적으로 수행 할 수 있으며 조직은 오가노이드 배양 및 ROMA를 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있습니다. 미래에는 ROMA를 적용하여 체외에서 CFTR 조절제의 효능을 테스트할 수도 있습니다. 본 보고서의 목적은 ROMA에 사용되는 방법을 완전히 설명하고 다른 실험실에서 복제를 허용하는 것입니다.

212명의 피험자로부터의 오가노이드가 일상적인 임상 방문 동안 수집되었습니다. 직장 생검 절차 중 또는 후에 부작용이 발생하지 않았습니다. 오가노이드는 유전자형 및 임상 정보와 같은 피험자 특성에 눈이 먼 한 연구원에 의해 이미지화되었습니다. 저화질 이미지로 인해 23 명의 피사체가 제외되었습니다. 성공 및 실패한 오가노이드 배양 및 이미지 획득의 예는 그림 2에...

Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

이 프로토콜은 낭포성 섬유증(CF)에 대한 새로운 진단 분석인 직장 오가노이드 형태 분석(ROMA)을 설명합니다. 형태 학적 특성, 즉 진원도 (원형도 지수, CI)와 루멘의 존재 (강도 비율, IR)는 CFTR 기능의 척도입니다. 189 명의 피험자를 분석 한 결과 CF와 비 CF가 완벽하게 구별되었습니다.

직장 오가노이드 형태 분석(ROMA): 낭포성 섬유증의 진단 분석

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMA는 질병을 유발하는 CFTR 돌연변이가 2개 미만이고 땀불소가 중간일 때 낭포성 섬유증이 있는 피험자와 없는 피험자의 오가노이드를 구별할 수 있습니다. ROMA는 모든 연령대에서 낮은 합병증 발생률로 수행 할 수 있습니다. 분석은 반자동화되고 표준화되며 생검은 분석을 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있습니다.ROMA에 사용되는 오가노이드는 CFTR 조절 효능에 접근하는 데에도 사용할 수 있으며 ROMA는 CFTR 기능의 회복 정도를 측정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 도금 후 하루 만에 오가노이드를 칼슘 그린으로 염색하십시오. 뚜껑을 덮은 상태에서 플레이트를 몇 번 회전시키고 약간 기울여 전체 우물에서 칼슘 그린의 균일 한 분포를 보장합니다.웰의 모든 유기체가 염색되도록 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 15-30분 동안 플레이트를 다시 배양합니다. 오가노이드에 초점을 맞추려면 최적의 X 및 Y 위치를 결정하고 컨포칼 현미경을 사용하여 각 웰의 오가노이드에 수동으로 초점을 맞춥니다. 그리고 이러한 위치를 이미징 소프트웨어에 저장합니다.다음으로, 라이브 셀 이미징 설정을 사용하여 방출을 488나노미터로, 여기를 515나노미터로, LD 배율 대물렌즈를 5X로 설정합니다. 오가노이드 사진을 획득하려면 컨포칼 현미경을 사용하여 1024 x 1024 픽셀의 해상도와 16 비트 깊이의 단위 방향 방식으로 이미지를 촬영하십시오. 낭포성 섬유증과 비낭포성 섬유증 오가노이드 간의 형태학적 차이를 최적으로 시각화하기 위해 레이저 강도와 마스터 게인을 선택하십시오.실험을 시작하여 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 현미경 형식으로 32개 웰 모두에 대해 웰당 하나의 사진을 저장하고 TIFF 파일로 내보냅니다. 먼저 이미지 분석 소프트웨어에서 TIFF 파일을 로드한 다음 운영자가 결정한 제외 기준에 따라 첫 번째 품질 검사를 수행합니다.도금 밀도가 부적절할 때, 오가노이드가 너무 많거나 너무 적은 경우, 형광 분포가 부적절한 경우 많은 분화되거나 죽은 구조 또는 파편이 존재하는 경우 사진 세트를 제외합니다. 분석할 영상을 준비하려면 각 오가노이드 배양에 대해 32개 그림 모두의 네트워크 데이터 파일 하나를 만들고 열어 대상당 32개 그림을 모두 동시에 분석할 수 있습니다. 그리고 하나의 픽셀이 2.5 x 2.5 마이크로미터에 해당하도록 이미지를 재보정합니다.그런 다음 강도 하한 임계 값 4, 500과 상한 임계 값 65, 535를 사용하여 구조를 묘사하고 부드럽고 깨끗한 기능을 끄고 채우기 구멍 기능을 켜고 별도의 기능을 3X로 설정합니다. 유기체를 계산하려면 40 마이크로 미터 이상의 모든 구조를 선택하십시오. 다음으로 ND 측정 업데이트 버튼을 클릭하면 계수된 오가노이드에 번호가 매겨집니다.계산을 위해 강도와 원형도를 측정하려면 60마이크로미터 이상의 모든 구조를 선택하고 계산하십시오. 그런 다음 그림의 경계에 닿는 모든 구조를 제거하십시오. 다음으로, 각각의 경계로부터 1 픽셀을 침식하고, 60 마이크로미터 이상 또는 그 이상이고, 각 구조의 평균 강도를 측정한다.그런 다음 60마이크로미터 이상의 모든 구조를 다시 선택하고 각 구조의 경계에서 10픽셀, 60마이크로미터 이상 또는 같은 구조를 침식합니다. 그런 다음 침식된 각 구조의 평균 강도와 각 구조의 원형도를 측정합니다. 그런 다음, 강도 측정 후 강도 측정 후 각각의 경계로부터 25 마이크로미터 이상, 60 마이크로미터 이상 또는 각각의 경계로부터 2.5 마이크로미터 침식 후의 강도 측정의 평균으로 나누어 강도비를 계산하고, 60 마이크로미터 이상 또는 같게 한다.원고에 설명된 대로 소프트웨어에 의해 결정된 제외 기준에 따라 두 번째 품질 검사를 수행합니다. 212명의 피험자로부터 오가노이드를 수집하고 이미지화했습니다. 23 세트의 사진을 제외하고 낭포 성 섬유증과 CFTR 돌연변이를 일으키는 2 가지 질병을 가진 167 명의 피험자 및 22 명의 비 낭포 성 섬유증 피험자로부터의 오가노이드 사진을 분석 한 결과, 배양 당 평균 오가노이드 수는 1, 519 인 것으로 나타났다.강도 비율과 원형도 지수는 낭포성 섬유증이 있거나 없는 피험자의 오가노이드에 대해 결정되었습니다. 이 두 지수를 사용하여 낭포성 섬유증이 있는 피험자와 없는 피험자의 오가노이드 간에 32개 웰 모두의 데이터를 사용할 때뿐만 아니라 각 배양에 대해 무작위로 8개의 웰을 선택했을 때 완벽한 구별을 얻었습니다. 4 개의 예시적인 배양에 대한 히스토그램을 얻었으며, 원형도에 대한 값의 분포, 오가노이드의 중앙 부분의 강도 및 전체 오가노이드의 강도를 보여줍니다.강도비와 원형도 지수를 정확하게 계산하려면 고품질 사진이 필요하기 때문에 품질 관리가 필수적입니다. ROMA를 위해 확립된 오가노이드 배양물은 CFTR 치료의 효과를 테스트하기 위한 물리학 보조에도 사용될 수 있습니다. RNA, DNA 및 단백질은 CFTR 변이체의 추가 특성 분석을 위해 추출할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

마우스 다이어프램 기능의 진단 초음파 이미징

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

연구

의학

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

마우스의 탁산의 약동학 및 약력 학적 분석을위한 경동맥 팅크

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

쥐에이 dimethylnitrosamine 유도 된 간 섬유화 모델

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 분석 낭포 성 섬유증 환자의 약물 반응을 평가하기위한

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

코 막 Transepithelial 잠재력 차이 (NPD)의 표준화 된 측정

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Β-aminopropionitrile-유도 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 Aortopathy의 양적 마이크로 CT 분석

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...