Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Vi takker pasienter og foreldre som deltok i denne studien. Vi takker Abida Bibi for alt kulturarbeid med organoidene. Vi takker Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz og Bernard Wenderickx for logistikkstøtte. Vi takker også Mucovereniging / Association Muco, og spesielt Stefan Joris og Dr. Jan Vanleeuwe, for deres støtte og finansiering. Vi takker alle samarbeidspartnere fra det belgiske organoidprosjektet: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgia), Linda Boulanger (Universitetssykehusene Leuven, Belgia), Georges Casimir (HUDERF, Brussel, Belgia), Benedicte De Meyere (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Elke De Wachter (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Danny De Looze (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Laurence Hanssens (HUDERF, Brussel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Monique Lequesne (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Eva Van Braeckel (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Eef Vanderhelst (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Stijn Verhulst (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Stefanie Vincken (Universitetssykehuset Brussel, Belgia).

For alle prosedyrer som involverer menneskelig vev, ble det innhentet godkjenning av etisk komité Research UZ/KU Leuven (EC research). All forskning ble utført med informert samtykke og / eller samtykke fra foreldre, representanter og / eller pasienter.
MERK: Alle prosedyrer som involverer rektalbiopsier og organoider bør utføres i en laminær strøm for å beskytte forskeren mot biologisk fare og for å minimere risikoen for forurensning av kulturene. Som for enhver laboratorieprosedyre, ...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+cystic+fibrosis:+Consensus+guidelines+from+the+cystic+fibrosis+foundation.">Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation.</a> The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).</li><li>Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+variability+of+the+sweat+chloride+in+diagnostic+sweat+tests:+A+retrospective+analysis.">Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids:+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients.">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).</li><li>Friedmacher, F., Puri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+suction+biopsy+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung's+disease:+a+systematic+review+of+diagnostic+accuracy+and+complications.">Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications.</a> Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis.">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

Vi gir en detaljert protokoll for rektal organoid morfologi analyse (ROMA). De to indeksene beregnet med ROMA, IR og CI, skilte organoider fra personer med CF fra de uten CF med perfekt nøyaktighet. ROMA kan dermed fungere som en ny fysiologisk CFTR-analyse komplementær til SCC og andre tilgjengelige tester13,14,15.
Protokollen er avhengig av bruk av tarmorganoider, som har en rund form og sentral l...

Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv sykdom forårsaket av mutasjoner i CF transmembran konduktansregulator (CFTR) genet. CFTR-proteinet er en klorid- og bikarbonatkanal, noe som sikrer hydrering av flere epitel1. CF er en høybelastende, livsforkortende, multisystemsykdom, som først og fremst manifesterer seg som en luftveissykdom, men påvirker også mage-tarmkanalen, bukspyttkjertelen, leveren og reproduktive kanalen2.
Sykdomsfremkallende mutasjoner i CFTR fører til en reduksjon i mengden eller funksjonen av CFTR, noe som igjen forårsaker dehydrering av slim. Mer enn 2000 varianter i CFTR-genet er beskrevet3, hvorav bare 466 har blitt grundig karakterisert4.
En diagnose av CF kan gjøres når enten svettekloridkonsentrasjonen (SCC) er over terskelen på 60 mmol / L eller når to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner (ifølge CFTR2-databasen) er identifisert 4,5. Hos personer med bare middels forhøyet (30-60 mmol / L) SCC, som forekommer i ca. 4% -5% av svettetester6, og CFTR-mutasjoner av varierende eller ukjent klinisk konsekvens, kan diagnosen ikke bekreftes eller utelukkes, selv når de har CF-kompatible symptomer eller en positiv neonatal screeningstest. For disse tilfellene har andrelinje fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell (NPD) og tarmstrømmålinger (ICM)) blitt inkludert i den diagnostiske algoritmen. Disse testene er ikke lett tilgjengelige på de fleste sentre og heller ikke gjennomførbare i alle aldre, spesielt hos spedbarn5.
Rektale organoider er 3D-strukturer dyrket fra Lgr5 (+) voksne intestinale stamceller fra tarmkrypter oppnådd gjennom rektal biopsi7. Organoider brukes i økende grad i biomedisinsk forskning, for eksempel testing av modulatorbehandling i CF8. En levedyktig biopsi kan oppnås ved enten suge- eller tangbiopsi, en prosedyre som bare forårsaker minimal ubehag og er trygg selv hos spedbarn, med lave komplikasjonsrater9. Kryptene isolert fra rektalbiopsiene er beriket i stamceller, og under spesifikke dyrkingsforhold organiserer disse seg selv i rektalorganoider. Morfologien til disse organoider bestemmes av uttrykket og funksjonen til CFTR, lokalisert ved den apikale membranen av epitelceller. Funksjonell CFTR tillater klorid og vann å komme inn i organoidlumen, og derved indusere hevelse av ikke-CF-organoider. CF-organoider svulmer ikke og har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologi analyse (ROMA) tillater diskriminering mellom CF og ikke-CF organoider basert på disse forskjellene i organoid morfologi. Ikke-CF-organoider er mer runde og har et synlig lumen, mens det motsatte er tilfelle for CF-organoider. For denne analysen er pasientspesifikke organoider belagt i 32 brønner i en 96-brønnplate. Etter 1 dag med dyrking, er organoider farget med calcein grønn og avbildet i et konfokalt mikroskop. De ikke-CF-organoider viser en mer sirkulær form og en mindre fluorescerende sentral del, da lumen inneholder væske og calcein flekker bare celler. Disse forskjellene i morfologi kvantifiseres ved hjelp av to ROMA-indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, mens intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen eller fraværet av et sentralt lumen. I denne rapporten beskriver vi i detalj protokollen for å oppnå disse diskriminerende indeksene, for å tillate replikering av teknikken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

Diagnosen cystisk fibrose (CF) er ikke alltid enkel, spesielt når konsentrasjonen av svetteklorid er middels og/eller mindre enn to sykdomsfremkallende mutasjoner av CFTR kan identifiseres. Fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell, måling av tarmstrøm) er inkludert i den diagnostiske algoritmen, men er ikke alltid lett tilgjengelige eller gjennomførbare (f.eks. hos spedbarn). Rektale organoider er 3D-strukturer som vokser fra stamceller isolert fra krypter av en rektal biopsi når de dyrkes under spesifikke forhold. Organoider fra ikke-CF-personer har en rund form og et væskefylt lumen, da CFTR-mediert kloridtransport driver vann inn i lumen. Organoider med defekt CFTR-funksjon svulmer ikke, beholder en uregelmessig form og har ingen synlig lumen. Forskjeller i morfologi mellom CF og ikke-CF organoider er kvantifisert i 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) som en ny CFTR fysiologisk analyse. For ROMA-analysen er organoider belagt i 96-brønnplater, farget med calcein og avbildet i et konfokalt mikroskop. Morfologiske forskjeller kvantifiseres ved hjelp av to indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, og intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen av et sentralt lumen. Ikke-CF-organoider har høy KI og lav IR sammenlignet med CF-organoider. ROMA-indekser diskriminerte perfekt 167 personer med CF fra 22 personer uten CF, noe som gjorde ROMA til en tiltalende fysiologisk CFTR-analyse for å hjelpe til med CF-diagnose. Rektale biopsier kan rutinemessig utføres i alle aldre på de fleste sykehus, og vev kan sendes til et sentralt laboratorium for organoidkultur og ROMA. I fremtiden kan ROMA også brukes til å teste effekten av CFTR-modulatorer in vitro. Målet med denne rapporten er å fullt ut forklare metodene som brukes for ROMA, for å tillate replikering i andre laboratorier.

Organoider fra 212 forsøkspersoner ble samlet inn under rutinemessige kliniske besøk. Ingen bivirkninger forekom under eller etter rektal biopsi-prosedyren. Organoider ble avbildet av en forsker blindet for fagegenskaper som genotype og klinisk informasjon. På grunn av bilder av lav kvalitet ble 23 forsøkspersoner ekskludert. Eksempler på vellykkede og mislykkede organoidkulturer og bildetilegnelse kan ses i figur 2.
Organoider med 167 pasienter med CF og to ...

Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Denne protokollen beskriver rektal organoid morfologi analyse (ROMA), en ny diagnostisk analyse for cystisk fibrose (CF). Morfologiske egenskaper, nemlig rundheten (sirkularitetsindeks, CI) og tilstedeværelsen av et lumen (intensitetsforhold, IR), er et mål på CFTR-funksjonen. Analyse av 189 forsøkspersoner viste perfekt diskriminering mellom CF og ikke-CF.

Rektal organoid morfologi analyse (ROMA): En diagnostisk analyse i cystisk fibrose

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMA kan diskriminere mellom organoider fra personer med og uten cystisk fibrose når mindre enn to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner er funnet og når svettefluorid er mellomliggende. ROMA kan utføres i alle aldre og med lave komplikasjonsrater. Analysen er halvautomatisert og standardisert, og biopsier kan sendes til et sentralt laboratorium for analyse.Organoider som brukes til ROMA kan også brukes til å få tilgang til CFTR-modulerende effekt, og ROMA kan hjelpe til med å måle graden av restaurering av CFTR-funksjonen. En dag etter plating, flekk organoider med kalsiumgrønn. Roter og vipp platen litt med lokket på et par ganger for å sikre homogen fordeling av kalsiumgrønn i hele brønnen.Inkuber platen igjen, i 15 til 30 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for å sikre farging av alle organoider i brønnene. For å fokusere på organoider, bestemme den optimale X- og Y-posisjonen, og fokusere på organoider i hver brønn manuelt, ved hjelp av konfokalmikroskopet. Og lagre disse stillingene i bildebehandlingsprogramvaren.Deretter bruker du levende cellebildeinnstillinger, sett utslippet på 488 nanometer og eksitasjon ved 515 nanometer, og et LD-forstørrelsesmål ved 5X. For å skaffe organoidbilder, ta bilder på en retningsbestemt måte med en oppløsning på 1024 piksler med 1024 piksler, og en dybde på 16 bits med konfokalmikroskopet. Velg laserintensitet og mastergevinst for optimal visualisering av morfologiske forskjeller mellom cystisk fibrose og ikke-cystisk fibrose organoider.Start eksperimentet for å ta bildene. Etterpå lagrer du ett bilde per brønn for alle 32 brønner i mikroskopformat og eksporterer dem som TIFF-filer. Last først TIFF-filene i bildeanalyseprogramvaren og utfør deretter den første kvalitetskontrollen basert på eksklusjonskriterier bestemt av operatøren.Ekskluder settet med bilder hvis mange differensierte eller døde strukturer eller rusk er tilstede når pletteringstettheten er utilstrekkelig, når for mange eller for få organoider er tilstede, og i tilfelle utilstrekkelig fluorescensfordeling. For å klargjøre bilder for analyse, opprett og åpne en nettverksdatafil med alle 32 bilder for hver organoidkultur, noe som muliggjør samtidig analyse av alle 32 bilder per emne. Og kalibrer bildene på nytt slik at en piksel tilsvarer 2,5 x 2,5 mikrometer.Avgrens deretter strukturer ved hjelp av en lavere intensitetsterskel på 4.500 og en øvre terskel på 65.535, slå av de glatte og rene funksjonene, slå på fyllhullfunksjonen og sett den separate funksjonen på 3X. For å telle organoider, velg alle strukturer mer enn eller lik 40 mikrometer. Deretter klikker du på oppdater ND-målingsknappen, og de talte organoider blir nummerert.For å måle intensitet og sirkularitet for beregning, velg alle strukturer mer enn eller lik 60 mikrometer og antall. Fjern deretter alle strukturer som berører kantene på bildet. Deretter eroderer du en piksel fra grensen til hver, mer enn eller lik 60 mikrometer struktur, og måler gjennomsnittsintensiteten til hver struktur.Etterpå velger du alle strukturer mer enn eller lik 60 mikrometer igjen, og eroderer 10 piksler fra grensen til hver, mer enn eller lik 60 mikrometer struktur. Deretter måler du gjennomsnittsintensiteten til hver erodert struktur og sirkulariteten til hver struktur. Beregn deretter intensitetsforholdet ved å dele intensitetsmålingen etter å ha erodert 25 mikrometer fra grensen til hver, mer enn eller lik 60 mikrometer struktur med gjennomsnittet av intensitetsmålingen etter å ha erodert 2,5 mikrometer fra grensen til hver, mer enn eller lik 60 mikrometer struktur.Utfør den andre kvalitetskontrollen basert på eksklusjonskriterier bestemt av programvaren som beskrevet i manuskriptet. Organoider fra 212 forsøkspersoner ble samlet inn og avbildet. Etter eksklusjon av 23 sett med bilder, organoidbilder fra 167 personer med cystisk fibrose og to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner og fra 22 ikke-cystisk fibrose-ble analysert, ble gjennomsnittlig antall organoider per kultur funnet å være 1, 519.Intensitetsforholdet og sirkularitetsindeksen ble bestemt for organoider fra personer med og uten cystisk fibrose. Ved å bruke disse to indeksene ble det oppnådd perfekt diskriminering mellom organoider fra personer med og uten cystisk fibrose, ikke bare ved bruk av data fra alle 32 brønner, men også når åtte brønner ble valgt tilfeldig for hver kultur. Histogrammer for fire illustrative kulturer ble oppnådd, som viser fordelingen av verdier for sirkularitet, intensiteten av den sentrale delen av organoiden og intensiteten av hele organoiden.Kvalitetskontroll er viktig, da bilder av høy kvalitet er nødvendig for nøyaktig beregning av intensitetsforholdet og sirkularitetsindeksen. Organoidkulturer etablert for ROMA kan også brukes til fysikkhjelpemidler for å teste effekten av CFTR-behandling. RNA, DNA og protein kan ekstraheres for videre karakterisering av CFTR-varianter.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Membran Funksjon

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Den Dimethylnitrosamine indusert leverfibrose Model i Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Halvautomatisk analyse av musen Skjelettmuskel morfologi og Fiber-type sammensetning

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimalisert LC--MS-/ MS metoden for høy gjennomstrømming analyse av klinisk prøver av Ivacaftor, store metabolitter og Lumacaftor i biologiske væsker Cystic Fibrosis pasienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Standardisert måling av nese membran Transepithelial potensielle forskjellen (OD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Kvantitativ mikro-CT analyse av Aortopathy i en musemodell av β-aminopropionitrile-indusert aortaaneurisme og disseksjon

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Design og utvikling av en modell for å studere effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose luftveismikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...