Name: rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis
Uploaded: 2022-06-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis at JoVE.com

Agradecemos a los pacientes y padres que participaron en este estudio. Agradecemos a Abida Bibi por todo el trabajo de cultivo con los organoides. Agradecemos a Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz y Bernard Wenderickx por su apoyo logístico. También agradecemos a Mucovereniging/Association Muco, y específicamente a Stefan Joris y al Dr. Jan Vanleeuwe, por su apoyo y financiación. Agradecemos a todos los colaboradores del Proyecto Organoide Belga: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Lieja, Bélgica), Linda Boulanger (Hospitales Universitarios de Lovaina, Bélgica), Georges Casimir (HUDERF, Bruselas, Bélgica), Benedicte De Meyere (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Elke De Wachter (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica), Danny De Looze (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruselas, Bélgica), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruselas), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruselas, Bélgica), Monique Lequesne (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Stephanie Van Biervliet (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Eva Van Braeckel (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Kim Van Hoorenbeeck (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Eef Vanderhelst (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica), Stijn Verhulst (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Stefanie Vincken (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica).

Para todos los procedimientos con tejido humano, se obtuvo la aprobación del Comité de Ética de Investigación UZ/KU Leuven (investigación de la CE). Todas las investigaciones se realizaron con el consentimiento informado y/o el consentimiento de los padres, representantes y/o pacientes.
NOTA: Todos los procedimientos que involucren biopsias rectales y organoides deben realizarse en un flujo laminar para proteger al investigador de cualquier peligro biológico y minimizar el riesgo de cont...

<ol>
	<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA.">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).</li><li>Castellani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECFS+best+practice+guidelines:+the+2018+revision.">ECFS best practice guidelines: the 2018 revision.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).</li><li>. CFTR2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cftr2.org/">https://www.cftr2.org/</a> (2022)</li><li>Farrell, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Cuyx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+organoid+morphology+analysis+(ROMA)+as+a+promising+diagnostic+tool+in+cystic+fibrosis.">Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis.</a> Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).</li><li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+gene+and+in+vivo+transepithelial+potentials.">Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li><li>Ramalho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+intestinal+organoids+to+guide+treatment+of+Cystic+Fibrosis.">Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).</li></ol>

Proporcionamos un protocolo detallado para el análisis morfológico de organoides rectales (ROMA). Los dos índices calculados con ROMA, IR e IC, distinguieron organoides de sujetos con FQ de aquellos sin FQ con perfecta precisión. ROMA podría funcionar como un nuevo ensayo fisiológico CFTR complementario al SCC y otras pruebas actualmente disponibles13,14,15.
El protocolo depende del uso de organ...

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR). La proteína CFTR es un canal de cloruro y bicarbonato, asegurando la hidratación de varios epitelios1. La FQ es una enfermedad multisistémica de alta carga, que acorta la vida, que se manifiesta principalmente como una enfermedad respiratoria, pero que también afecta al tracto gastrointestinal, el páncreas, el hígado y el tracto reproductivo2.
Las mutaciones CFTR causantes de la enfermedad conducen a una disminución en la cantidad o función de CFTR, lo que a su vez causa deshidratación del moco. Se han descrito más de 2.000 variantes en el gen CFTR 3, de las cuales sólo 466 han sido ampliamente caracterizadas4.
Se puede hacer un diagnóstico de FQ cuando la concentración de cloruro en sudor (CCE) está por encima del umbral de 60 mmol / L o cuando se identifican dos mutaciones CFTR causantes de la enfermedad (según la base de datos CFTR2) 4,5. En sujetos con SCC sólo moderadamente elevado (30-60 mmol/L), que ocurre en alrededor del 4%-5% de las pruebas de sudor6, y mutaciones CFTR de consecuencia clínica variable o desconocida, el diagnóstico no puede ser confirmado ni descartado, incluso cuando tienen síntomas compatibles con FQ o una prueba de cribado neonatal positiva. Para estos casos, se han incluido en el algoritmo de diagnóstico ensayos fisiológicos de segunda línea CFTR (diferencia de potencial nasal [NPD] y mediciones de corriente intestinal [MCI]). Estas pruebas no están fácilmente disponibles en la mayoría de los centros ni son factibles en todas las edades, especialmente en bebés5.
Los organoides rectales son estructuras 3D cultivadas a partir de células madre intestinales adultas Lgr5(+) de criptas intestinales obtenidas mediante biopsia rectal7. Los organoides se utilizan cada vez más en la investigación biomédica, como el tratamiento con moduladores de prueba en CF8. Una biopsia viable puede obtenerse por succión o biopsia con fórceps, un procedimiento que causa solo molestias mínimas y es seguro incluso en bebés, con bajas tasas de complicaciones9. Las criptas aisladas de las biopsias rectales están enriquecidas en células madre y, en condiciones de cultivo específicas, se autoorganizan en organoides rectales. La morfología de estos organoides está determinada por la expresión y función de CFTR, situado en la membrana apical de las células epiteliales. El CFTR funcional permite que el cloruro y el agua entren en la luz del organoide, induciendo así la hinchazón de los organoides no CF. Los organoides de FQ no se hinchan y no tienen luz visible10,11.
El análisis morfológico de organoides rectales (ROMA) permite la discriminación entre organoides CF y no CF en función de estas diferencias en la morfología de los organoides. Los organoides sin FQ son más redondos y tienen una luz visible, mientras que lo contrario es cierto para los organoides de FQ. Para este ensayo, los organoides específicos del paciente se colocan en 32 pocillos de una placa de 96 pocillos. Después de 1 día de crecimiento, los organoides se tiñen con verde calceína y se obtienen imágenes en un microscopio confocal. Los organoides no CF muestran una forma más circular y una parte central menos fluorescente, ya que la luz contiene líquido y la calceína tiñe solo las células. Estas diferencias en la morfología se cuantifican utilizando dos índices ROMA: el índice de circularidad (IC) cuantifica la redondez de los organoides, mientras que la relación de intensidad (IR) es una medida de la presencia o ausencia de un lumen central. En este informe, describimos en detalle el protocolo para obtener estos índices discriminativos, para permitir la replicación de la técnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>17040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for organoid culture as detailed in previous protocol10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000055, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>v.5.02.00</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (20, 200, and 1000 &#181;L)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>774288, 775353, 750288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>v2.6</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rectal organoid morphology analysis (roma): a diagnostic assay in cystic fibrosis

El diagnóstico de la fibrosis quística (FQ) no siempre es sencillo, especialmente cuando la concentración de cloruro en el sudor es intermedia y / o se pueden identificar menos de dos mutaciones CFTR causantes de la enfermedad. Los ensayos fisiológicos CFTR (diferencia de potencial nasal, medición de corriente intestinal) se han incluido en el algoritmo de diagnóstico, pero no siempre están disponibles o son factibles (p. ej., en lactantes). Los organoides rectales son estructuras 3D que crecen a partir de células madre aisladas de criptas de una biopsia rectal cuando se cultivan en condiciones específicas. Los organoides de sujetos sin FQ tienen una forma redonda y una luz llena de líquido, ya que el transporte de cloruro mediado por CFTR conduce el agua hacia el lumen. Los organoides con función CFTR defectuosa no se hinchan, conservando una forma irregular y sin luz visible. Las diferencias en la morfología entre los organoides CF y no CF se cuantifican en el 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) como un nuevo ensayo fisiológico CFTR. Para el ensayo ROMA, los organoides se colocan en placas de 96 pocillos, se tiñen con calceína y se obtienen imágenes en un microscopio confocal. Las diferencias morfológicas se cuantifican utilizando dos índices: el índice de circularidad (IC) cuantifica la redondez de los organoides, y la relación de intensidad (IR) es una medida de la presencia de un lumen central. Los organoides sin FQ tienen un IC alto y un IR bajo en comparación con los organoides de FQ. Los índices ROMA discriminaron perfectamente a 167 sujetos con FQ de 22 sujetos sin FQ, lo que hace de ROMA un ensayo fisiológico CFTR atractivo para ayudar en el diagnóstico de FQ. Las biopsias rectales se pueden realizar rutinariamente a todas las edades en la mayoría de los hospitales y el tejido se puede enviar a un laboratorio central para cultivo de organoides y ROMA. En el futuro, ROMA también podría aplicarse para probar la eficacia de los moduladores CFTR in vitro. El objetivo del presente informe es explicar plenamente los métodos utilizados para la ROMA, a fin de permitir la replicación en otros laboratorios.

Se recolectaron organoides de 212 sujetos durante las visitas clínicas de rutina. No se produjeron eventos adversos durante o después del procedimiento de biopsia rectal. Los organoides fueron fotografiados por un investigador cegado a las características del sujeto, como el genotipo y la información clínica. Debido a las imágenes de baja calidad, 23 sujetos fueron excluidos. En la Figura 2 se pueden ver ejemplos de cultivos de organoides exitosos y fallidos y adquisición de imágenes...

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Rectal Organoid Morphology Analysis ROMA: A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

Este protocolo describe el análisis de morfología organoide rectal (ROMA), un nuevo ensayo diagnóstico para la fibrosis quística (FQ). Las características morfológicas, a saber, la redondez (índice de circularidad, IC) y la presencia de un lumen (relación de intensidad, IR), son una medida de la función CFTR. El análisis de 189 sujetos mostró una discriminación perfecta entre FQ y no FQ.

Análisis de morfología organoide rectal (ROMA): un ensayo de diagnóstico en fibrosis quística

Diagnosis of cystic fibrosis (CF) is not always straightforward, especially when sweat chloride concentration is intermediate and/or less than two ...

ROMA puede discriminar entre organoides de sujetos con y sin fibrosis quística cuando se encuentran menos de dos mutaciones CFTR causantes de enfermedades y cuando el fluoruro en sudor es intermedio. ROMA se puede realizar en todas las edades y con bajas tasas de complicaciones. El análisis es semiautomatizado y estandarizado y las biopsias se pueden enviar a un laboratorio central para su análisis.Los organoides utilizados para ROMA también se pueden usar para acceder a la eficacia moduladora de CFTR, y ROMA podría ayudar a medir el grado de restauración de la función de CFTR. Un día después del emplatado, tiñe los organoides con verde calcio. Gire e incline ligeramente la placa con la tapa puesta varias veces para garantizar una distribución homogénea del verde calcio en todo el pozo.Incubar la placa nuevamente, durante 15 a 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para asegurar la tinción de todos los organoides en los pozos. Para enfocar los organoides, determine la posición óptima X e Y, y concéntrese en los organoides en cada pocillo manualmente, usando el microscopio confocal. Y guarde estas posiciones en el software de imágenes.A continuación, utilizando la configuración de imágenes de células vivas, establezca la emisión en 488 nanómetros y la excitación en 515 nanómetros, y un objetivo de aumento LD en 5X. Para adquirir imágenes organoides, tome imágenes de forma direccional unitaria con una resolución de 1024 píxeles por 1024 píxeles, y una profundidad de 16 bits con el microscopio confocal. Elija la intensidad del láser y la ganancia maestra para una visualización óptima de las diferencias morfológicas entre los organoides de fibrosis quística y los organoides de fibrosis no quística.Inicie el experimento para capturar las imágenes. Después, guarde una imagen por pocillo para los 32 pocillos en formato de microscopio y expórtelos como archivos TIFF. Primero, cargue los archivos TIFF en el software de análisis de imágenes y luego realice el primer control de calidad basado en los criterios de exclusión determinados por el operador.Excluir el conjunto de imágenes si hay muchas estructuras o escombros diferenciados o muertos cuando la densidad del recubrimiento es inadecuada, cuando hay demasiados o muy pocos organoides y en caso de distribución inadecuada de la fluorescencia. Para preparar las imágenes para el análisis, cree y abra un archivo de datos de red de las 32 imágenes para cada cultivo de organoide, lo que permite el análisis simultáneo de las 32 imágenes por sujeto. Y recalibre las imágenes para que un píxel corresponda a 2,5 por 2,5 micrómetros.Luego, delinee las estructuras usando un umbral de intensidad más bajo de 4, 500 y un umbral superior de 65, 535, apagando las funciones lisas y limpias, activando la función de orificios de relleno y poniendo la función separada en 3X. Para contar los organoides, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 40 micrómetros. A continuación, haga clic en el botón de actualización de medición ND y los organoides contados se numerarán.Para medir la intensidad y la circularidad para el cálculo, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 60 micrómetros y cuente. Luego, retire todas las estructuras que tocan los bordes de la imagen. A continuación, erosione un píxel del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros, y mida la intensidad media de cada estructura.Después, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 60 micrómetros de nuevo, y erosione 10 píxeles del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros. Luego, mide la intensidad media de cada estructura erosionada y la circularidad de cada estructura. Luego, calcule la relación de intensidad dividiendo la medición de intensidad después de erosionar 25 micrómetros del borde de cada estructura de más o igual a 60 micrómetros por la media de la medición de intensidad después de erosionar 2.5 micrómetros del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros.Realice el segundo control de calidad basado en criterios de exclusión determinados por el software como se describe en el manuscrito. Se recolectaron organoides de 212 sujetos y se obtuvieron imágenes. Después de la exclusión de 23 conjuntos de imágenes, se analizaron imágenes organoides de 167 sujetos con fibrosis quística y dos mutaciones CFTR causantes de enfermedad y de 22 sujetos con fibrosis no quística, se encontró que el número medio de organoides por cultivo era 1, 519.La relación de intensidad y el índice de circularidad se determinaron para organoides de sujetos con y sin fibrosis quística. Usando estos dos índices, se obtuvo una discriminación perfecta entre organoides de sujetos con y sin fibrosis quística, no solo cuando se utilizaron datos de los 32 pocillos, sino también cuando se eligieron ocho pocillos al azar para cada cultivo. Se obtuvieron histogramas para cuatro cultivos ilustrativos, mostrando la distribución de valores para la circularidad, la intensidad de la parte central del organoide y la intensidad de todo el organoide.El control de calidad es esencial, ya que se requieren imágenes de alta calidad para un cálculo preciso de la relación de intensidad y el índice de circularidad. Los cultivos de organoides establecidos para ROMA también se pueden usar como ayudas físicas para probar el efecto del tratamiento con CFTR. El ARN, el ADN y la proteína se pueden extraer para una mayor caracterización de las variantes de CFTR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis

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Investigación

Medicina

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