Name: isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل كلية برات للهندسة في جامعة ديوك ، وقسم أمراض الكلى في قسم الطب في ديوك ، ومنحة وايتهيد في البحوث الطبية الحيوية ، وجائزة أبحاث Genentech ل S. Musah. حصل Y. Roye على منحة جامعة ديوك - مؤسسة ألفريد بي سلون وزمالة ويليام إم "مونتي" رايشرت للدراسات العليا من قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة ديوك. تم إنشاء خط خلايا iPS DU11 (استنساخ جامعة ديوك # 11) في منشأة Duke iPSC الأساسية وتم توفيره لنا من قبل مختبر Bursac في جامعة ديوك. ويشكر المؤلفون ن. أبوتالب وج. هولمز ور. بهاتاشاريا وي. تشو على المساعدة التقنية والمناقشات المفيدة. كما يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر موسى على تعليقاتهم المفيدة على المخطوطة. يشكر المؤلفون مختبر Segura Lab على هدية مقياس التدفق الخلوي Acuri C6.

1. إعداد حلول مصفوفة الغشاء السفلي والركائز المطلية
<ol><li>إذابة مصفوفة الغشاء السفلي 1 بين عشية وضحاها على الجليد عند 4 درجات مئوية. Aliquot وفقا لاقتراح الشركة المصنعة لنسبة التخفيف. باستخدام أنبوب مخروطي وماصة سعة 50 مل ، امزج جيدا كمية مناسبة من مصفوفة الغشاء السفلي 1 في 25 مل من DMEM / F12...

<ol>
	<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disease+model+of+diabetic+nephropathy+in+a+glomerulus-on-a-chip+microdevice.">A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice.</a> Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).</li><li>Petrosyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glomerulus-on-a-chip+to+recapitulate+the+human+glomerular+filtration+barrier.">A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier.</a> Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).</li><li>Hass, R., Kasper, C., B&#246;hm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).</li><li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity:+when+do+differences+make+a+difference.">Cellular heterogeneity: when do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li><li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+cultured+podocytes.">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip.">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li><li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions.">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).</li><li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium.">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967 (2021).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li><li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes.">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li><li>Privratsky, J. R., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1:+regulator+of+endothelial+junctional+integrity.">PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).</li><li>Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+components+and+crosstalk.">The glomerular filtration barrier: components and crosstalk.</a> International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).</li><li>Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+human+iPSC-derived+vascular+endothelial+cells+under+physiological+shear+stress.">Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).</li><li>Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+productivity+crisis+in+pharmaceutical+R&amp;D.">The productivity crisis in pharmaceutical R&amp;D.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li><li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome.">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li></ol>

في هذا التقرير ، نوجز بروتوكولا لاشتقاق بطانة الأوعية الدموية والظهارة الكبيبية (podocytes) من خط خلايا iPS بشري متساوي المنشأ واستخدام هذه الخلايا لهندسة نظام 3D organ-on-a-chip الذي يحاكي البنية ، وواجهة الأنسجة والأنسجة ، ووظيفة الترشيح الجزيئي لكبيبات الكلى. تم تجهيز رقاقة الكبيبات هذه بالظهارة ال...

أجهزة Organ-on-a-chip هي نماذج ديناميكية 3D في المختبر تستخدم التحفيز الجزيئي والميكانيكي ، بالإضافة إلى الأوعية الدموية ، لتشكيل واجهات الأنسجة والأنسجة التي تنمذج بنية ووظيفة أعضاء معينة. تتكون الأجهزة التي تم إنشاؤها سابقا على رقاقة والتي تهدف إلى تلخيص كبيبات الكلى (رقائق الكبيبات) من خطوط الخلايا الحيوانية1 أو خطوط الخلايا الأولية والخالدة البشرية من مصادر غير متجانسة 2,3. يقدم استخدام مصادر الخلايا غير المتجانسة وراثيا اختلافات تحد بشكل كبير من دراسات الاستجابات الخاصة بالمريض وعلم الوراثة أو آليات المرض 4,5. تعتمد مواجهة هذا التحدي على توافر خطوط الخلايا متساوية المنشأ التي تنشأ من أفراد محددين لديهم ملامح جزيئية وجينية محفوظة لتوفير بيئة دقيقة أكثر دقة للهندسة في النماذج المختبرية 2،3،6. يمكن الآن توليد خطوط الخلايا المتساوية المنشأ من أصل بشري بسهولة بسبب التقدم في زراعة خلايا iPS البشرية. نظرا لأن خلايا iPS البشرية عادة ما تكون مصدرها غير الغازي ، ويمكن أن تجدد ذاتيا إلى أجل غير مسمى ، وتتمايز إلى أي نوع من الخلايا تقريبا ، فإنها تعمل كمصدر جذاب للخلايا لإنشاء نماذج في المختبر ، مثل رقاقة الكبيبات 7,8. حاجز الترشيح الكبيبي هو الموقع الرئيسي لترشيح الدم. يتم ترشيح الدم أولا من خلال بطانة الأوعية الدموية ، الغشاء السفلي الكبيبي ، وأخيرا من خلال ظهارة متخصصة تسمى podocytes. تساهم جميع المكونات الثلاثة لحاجز الترشيح في الترشيح الانتقائي للجزيئات. يظهر هنا بروتوكول لإنشاء جهاز عضو على رقاقة متصل بالبطانة الوعائية والظهارة الكبيبية من مصدر خلية iPS بشري واحد. في حين أن هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص لهندسة شريحة متساوية المنشأ والأوعية الدموية لتلخيص حاجز الترشيح الكبيبي ، فإنه يوفر أيضا مخططا لتطوير أنواع أخرى من الأعضاء الشخصية على الرقائق والمنصات متعددة الأعضاء مثل نظام "الجسم على رقاقة" متساوي المنشأ.
يبدأ البروتوكول الموصوف هنا بالتمايز المتباعد لخلايا iPS البشرية إلى سلالتين منفصلتين - خلايا الأديم المتوسط الجانبية والأديم المتوسط ، والتي يتم تمييزها لاحقا إلى بطانة وعائية وظهارة كبيبية ، على التوالي. لتوليد خلايا الأديم المتوسط الجانبية ، تم زرع خلايا iPS البشرية على ألواح مصفوفة الغشاء السفلي 1 المغلفة وزرعها لمدة 3 أيام (بدون تبادل الوسائط) في وسط N2B27 المكمل بمنشط Wnt ، CHIR 99021 ، ومحفز الأديم المتوسط القوي ، العظام المورفوجينية 4 (BMP4). تميزت خلايا الأديم المتوسط الجانبية الناتجة سابقا بالتعبير عن brachyury (T) ، و Homeobox الشبيه بالمزيج (MIXL) ، و eomesodermin (EOMES) 9. في وقت لاحق ، تم استزراع خلايا الأديم المتوسط الجانبية لمدة 4 أيام في وسط مكمل ب VEGF165 و Forskolin لحث الخلايا البطانية الوعائية التي تم فرزها بناء على تعبير VE-Cadherin و / أو PECAM-1 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). تم توسيع الخلايا البطانية الوعائية الناتجة (viEC) عن طريق زراعتها على مصفوفة الغشاء السفلي 3 قوارير مغلفة حتى تصبح جاهزة للبذر في جهاز الموائع الدقيقة.
لتوليد خلايا الأديم المتوسط ، تم زرع خلايا iPS البشرية على ألواح مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة وزرعت لمدة يومين في وسط يحتوي على Activin A و CHIR99021. تميزت خلايا الأديم المتوسط الناتجة بالتعبير عن HAND1 و goosecoid و brachury (T) كما هو موضح سابقا2،10،11. للحث على تمايز خلايا الأديم المتوسط (IM) ، تم استزراع خلايا الأديم المتوسط لمدة 14 يوما في وسط مكمل ب BMP-7 و CHIR99021. تعبر خلايا IM الناتجة عن ورم Wilm's Tumor 1 (WT1) ، والجين المربع المقترن 2 (PAX2) ، والبروتين المرتبط الغريب الذي تم تخطيه (OSR-1) 2,10,11.
تم تصميم رقاقة متعددة الميثيل سيلوكسان (PDMS) ثنائية القناة قائمة على الموائع الدقيقة لتلخيص بنية حاجز الترشيح الكبيبي في المختبر. القناة البولية هي 1000 ميكرومتر × 1000 ميكرومتر (عرض × ارتفاع) وبعد القناة الشعرية هو 1000 ميكرومتر × 200 ميكرومتر (عرض × ارتفاع). تم تسهيل دورات التمدد والاسترخاء الدورية من خلال الغرف المجوفة الموجودة على كل جانب من جوانب القنوات السائلة. تم زرع الخلايا على غشاء PDMS مرن (بسماكة 50 ميكرومتر) يفصل بين القنوات البولية والشعيرات الدموية. تم تجهيز الغشاء بمسام سداسية (قطرها 7 ميكرومتر ، على بعد 40 ميكرومتر) للمساعدة في تعزيز الإشارات بين الخلايا (الشكل 1A)2,12. قبل يومين من اكتمال تحريض IM ، تم طلاء رقائق الموائع الدقيقة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي 2. تم زرع viECs في القناة الشعرية لرقاقة الموائع الدقيقة باستخدام وسيط الصيانة البطانية قبل 1 يوم من اكتمال تحريض IM ، وتم قلب الشريحة رأسا على عقب لتمكين التصاق الخلايا على الجانب القاعدي من غشاء PDMS المطلي ب ECM. في اليوم الذي تم فيه الانتهاء من تحريض IM ، تم زرع الخلايا في القناة البولية لرقاقة الموائع الدقيقة باستخدام وسط مكمل ب BMP7 و Activin A و CHIR99021 و VEGF165 وجميع حمض الريتينويك العابر للحث على تمايز الخلايا البودوسية داخل الشريحة. في اليوم التالي ، تم ملء خزانات الوسائط بوسط تحريض Podocyte ووسط الصيانة البطانية ، وتم تطبيق إجهاد ميكانيكي بنسبة 10٪ عند 0.4 هرتز وتدفق السوائل (60 ميكرولتر / ساعة) على الرقائق.
تم استزراع رقائق الموائع الدقيقة الخلوية لمدة 5 أيام إضافية باستخدام وسيط تحريض Podocyte (في القناة البولية) ووسط الصيانة البطانية (في القناة الوعائية). تم استزراع رقائق كبيبات الكلى الناتجة لمدة تصل إلى 7 أيام إضافية في وسائط الصيانة لكل من الخلايا الكبدية والخلايا البطانية. عبرت الخلايا البدوية المتباينة بشكل إيجابي عن البروتينات الخاصة بالسلالة ، بما في ذلك البودوسين والنيفرين13,14 ، في حين عبرت viECs بشكل إيجابي عن بروتينات تحديد النسب PECAM-1 و VE-Cadherin ، وكلها جزيئات أساسية للحفاظ على سلامة حاجز الترشيح الكبيبي15,16 . تم العثور على كل من podocytes و viECs لإفراز بروتين الغشاء السفلي الكبيبي الأكثر وفرة ، الكولاجين الرابع ، وهو أمر مهم أيضا لنضج الأنسجة ووظيفتها.
تم العثور على النظام المكون من ثلاثة مكونات لحاجز الترشيح - البطانة ، الغشاء السفلي ، والظهارة - في رقائق الكبيبات لتصفية الجزيئات بشكل انتقائي والاستجابة لعلاج دوائي كيميائي سام للكلى. أشارت نتائج العلاج الدوائي إلى أنه يمكن استخدام رقاقة الكبيبات لدراسات السمية الكلوية ونمذجة الأمراض. يوفر هذا البروتوكول المبدأ التوجيهي العام لهندسة رقاقة كبيبات الكلى الموائع الدقيقة الوظيفية من مشتقات خلايا iPS متساوية المنشأ. يمكن إجراء التحليلات النهائية للرقاقة الهندسية حسب رغبة الباحث. لمزيد من المعلومات حول استخدام رقاقة الكبيبات لنمذجة الإصابة الكبيبية الناجمة عن المخدرات ، راجع المنشورات السابقة 2,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14-9871-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podocin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>Basement membrane (3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>N8922012</td>
			<td>Basement membrane matrix (2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium growth factors and media supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A23017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x) without Vitamin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete medium kit with CultureBoost-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10565042</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin (Adenylyl cyclase activator)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP4</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin-FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Lateral mesoderm basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, liquid (100x)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 &#176;C or -20 &#176;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-Beta inhibitor (SB431542)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell detachment buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Suloxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97065-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA, 0.05%</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Orb) Hub module</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ORB-HM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15 mm round petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 x 120 mm square cell culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29442-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating Unit</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F19917-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B99516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>51030403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera</td>
			<td>Carl Zeiss Micrscopy</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leoca SP8 Upright Confocal Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir (POD Portable Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>POD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>S-1 Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ-chip holder</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>AK-CCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Asher</td>
			<td>Quorum tech</td>
			<td>K1050X RF</td>
			<td>This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University&#39;s Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#181;m, PES</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1138W14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75cm2 cell culture flask with vent cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-treated 6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)</td>
			<td>Emulate</td>
			<td>ZOE-CM1</td>
			<td>Organ Chip Bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-126-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 MicroBead Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isogenic kidney glomerulus chip engineered from human induced pluripotent stem cells

يؤثر مرض الكلى المزمن (CKD) على 15٪ من السكان البالغين في الولايات المتحدة ، ولكن إنشاء العلاجات المستهدفة كان محدودا بسبب عدم وجود نماذج وظيفية يمكنها التنبؤ بدقة بالاستجابات البيولوجية البشرية والسمية الكلوية. يمكن أن تساعد التطورات في الطب الدقيق للكلى في التغلب على هذه القيود. ومع ذلك ، فإن النماذج المختبرية التي تم إنشاؤها سابقا لكبيبات الكلى البشرية - الموقع الرئيسي لترشيح الدم والهدف الرئيسي للعديد من الأمراض وسمية الأدوية - عادة ما تستخدم مجموعات خلايا غير متجانسة ذات خصائص وظيفية محدودة وخلفيات وراثية لا مثيل لها. هذه الخصائص تحد بشكل كبير من تطبيقها على نمذجة الأمراض الخاصة بالمريض والاكتشاف العلاجي. 
تقدم هذه الورقة بروتوكولا يدمج الظهارة الكبيبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة بالإنسان (podocytes) والبطانة الوعائية من مريض واحد لهندسة رقاقة كبيبات الكلى المتحولة في الموائع الدقيقة والأوعية الدموية. تتكون رقاقة الكبيبات الناتجة من طبقات الخلايا البطانية والظهارية المشتقة من الخلايا الجذعية التي تعبر عن علامات خاصة بالسلالة ، وتنتج بروتينات الغشاء السفلي ، وتشكل واجهة نسيج الأنسجة تشبه حاجز الترشيح الكبيبي للكلية. تقوم رقاقة الكبيبات الهندسية بتصفية الجزيئات بشكل انتقائي وتلخص إصابة الكلى الناجمة عن الأدوية. القدرة على إعادة تشكيل هيكل ووظيفة كبيبات الكلى باستخدام أنواع الخلايا متساوية المنشأ يخلق الفرصة لنمذجة أمراض الكلى مع خصوصية المريض وتعزيز فائدة الأعضاء على رقائق للطب الدقيق الكلى والتطبيقات ذات الصلة.

هنا نظهر أن نموذج 3D وظيفي في المختبر من الكبيبات يمكن أن تكون الأوعية الدموية والظهارية من مصدر متساوي المنشأ من خلايا iPS البشرية. على وجه التحديد ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات حول كيفية تطبيق تقنية خلايا iPS البشرية ، وخاصة قدرتها على التمييز إلى أنواع الخلايا المتخصصة ، لتوليد ظهارة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

يظهر هنا بروتوكول لهندسة نظام شخصي للأعضاء على رقاقة يلخص بنية ووظيفة حاجز الترشيح الكبيبي للكلى من خلال دمج الخلايا البطانية الظهارية والوعائية المتطابقة وراثيا المتمايزة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن لهذا النظام المهندس بيولوجيا تطوير الطب الدقيق للكلى والتطبيقات ذات الصلة.

رقاقة كبيبات الكلى متساوية المنشأ المصممة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

ستمكن رقاقة الكبيبات متساوية المنشأ من نمذجة الأمراض الخاصة بالمريض واختبار السمية الكلوية وتطبيقات الطب الدقيق المتقدمة. تستمد الظهارة الكبيبية والبطانة من مجموعة واحدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، أو IPSCs. تمتلك IPSCs تجديدا ذاتيا غير محدود ويمكنها التمييز في أي نوع من الخلايا تقريبا.يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم الأنماط الظاهرية الخلوية المرضية والمرض. يمكن أن تكون رقاقة الأعضاء الخاصة بالمريض أيضا بمثابة منصة لفحص الأدوية والدراسات الميكانيكية. يمكن تطبيق هذا النموذج على تطوير جسم على نظام رقاقة مخصص لمريض معين.هذا النظام لديه القدرة على التنبؤ بالاستجابات الخاصة بالمريض قبل الاختبار السريري. ابدأ بإضافة 25 ميكرولتر بلطف من محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 إلى القناة البولية و 20 ميكرولتر إلى القناة الشعرية للرقاقة. خذ غطاءين من الأنبوب المخروطي المعقم سعة 15 ملليلتر واملأهما ب 500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.ضع الغطاء في طبق بتري لمنع التجفيف وضع الغطاء على الطبق. احتضنه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. المضي قدما ، استنشاق الوسط من قوارير T75 التي تحتوي على مزرعة لمدة 15 يوما من الخلايا البطانية الوعائية عند التقاء 90٪.أضف خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وأضف خمسة ملليلترات من DMEM / F-12. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق.قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم للحصول على ما يقرب من 2 مليون خلية. باستخدام طرف حاجز P200 ، اغسل كل من القنوات العلوية والسفلية لشريحة الموائع الدقيقة ب 200 ميكرولتر من DMEM / F-12 أثناء السحب في نفس الوقت من محيط المخرج.أمسك الشريحة بإحكام باستخدام طرف الحاجز P200 المتصل بالشافطة بعيدا عن مخرج القناة السفلية. حقن بقوة 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية الوعائية في القناة الشعرية للرقاقة وشفط الوسط بعناية من محيط المخرج. تحقق تحت المجهر من وجود فقاعات أو كثافة بذر غير متساوية.قم بعكس الشريحة بلطف حتى تتمكن الخلايا من الالتصاق بالجانب القاعدي من غشاء PDMS المرن. ضع الشريحة في خرطوشة الحامل وأضف ثلاثة ملليلترات من PBS إلى الخرطوشة لمنع الغشاء من الجفاف. احتضن الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.تحقق من القناة السفلية تحت المجهر بحثا عن طبقة متقاربة من الخلايا المرتبطة بغشاء PDMS المرن. اغسل الخلايا غير المتصلة بإضافة 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية على مدخل القناة السفلية أثناء الشفط من محيط منفذ القناة الشعرية. ضع الشريحة مرة أخرى في خرطوشة الحامل واحتضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.في اليوم التالي ، اغسل القناة الشعرية بلطف مع 200 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية. اغسل القناة البولية ب 200 ميكرولتر من DMEM / F-12 وأسقط 50 ميكرولتر من DMEM / F-12 على منافذ المدخل والمخرج. المضي قدما في خلايا الأديم المتوسط الوسيطة ، استبدل وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط من كل بئر من صفيحة البئر ال 12 بملليلتر واحد من Trypsin EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.كشط الخلايا بلطف باستخدام رافع الخلايا وفصل الخلايا باستخدام السحب. أضف ملليلترين من محلول تحييد التربسين إلى كل بئر وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. اجعل حجم تعليق الخلية يصل إلى 50 ملليلتر باستخدام DMEM / F-12 وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.شفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط للحصول على ما يقرب من 3 ملايين خلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. أمسك الشريحة وحقن 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا بإحكام في القناة البولية للرقاقة أثناء شفط الوسط بعناية من محيط المخرج.تحقق من وجود فقاعات أو كثافة بذر خلايا غير متساوية. أضف ثلاثة ملليلترات من PBS إلى خرطوشة حامل الشريحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخاص بكل منهما.قم بتوصيل أطراف حاجز P200 الفارغة في كل من منافذ القنوات البولية والشعيرات الدموية. ماصة 200 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل بحيث يتم توصيل كل من مدخل ومخرج القناة بأطراف ماصة مملوءة بمتوسطة.كرر هذا الإجراء لمدخل القناة البولية مع 200 ميكرولتر من وسيط صيانة الأديم المتوسط المتوسط. احتضن الرقائق بأطراف مدمجة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لتوصيل الرقائق بالمفاعل الحيوي لرقاقة الجهاز ، أولا ، قم بإزالة نصائح P200 من القنوات.أضف قطرات من الوسائط المعنية إلى مدخل ومخرج القنوات البولية والشعرية لمنع التجفيف. أضف ثلاثة ملليلترات من وسط تحريض الخلايا البودوسية الدافئة إلى خزان مدخل البول وثلاثة ملليلتر من وسط الصيانة البطانية الدافئة إلى خزان مدخل الشعيرات الدموية. أضف 300 ميكرولتر من الوسائط المعنية إلى خزانات المخرج مباشرة فوق منفذ المخرج.حرك القرون على الدرج وفي المفاعل الحيوي لرقاقة العضو. استخدم القرص الدوار لتحديد الدورة الرئيسية وتشغيلها لمدة دقيقتين. افحص بصريا الجانب السفلي من الجراب بحثا عن قطرات صغيرة في جميع المنافذ المائعة الأربعة.لتحقيق ملامسة السوائل بين الجانب السفلي من الجراب ومنافذ رقاقة الموائع الدقيقة ، حرك حامل الشريحة برفق في الجرب. اضغط برفق على علامة التبويب حامل الشريحة للداخل ولأعلى. استنشاق الوسط الزائد من سطح الشريحة.اضبط معدل تدفق المفاعل الحيوي لرقاقة العضو على 60 ميكرولتر في الساعة. اضبط السلالة الدورية على 10٪ عند 0.4 هرتز. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة العضو لتحديد دورة التنظيم وتشغيله لمدة ساعتين.افحص بصريا خزانات المخرج بحثا عن زيادة في مستوى الوسط. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة العضو لتحديد دورة التنظيم. بعد اليوم 17 من الثقافة، قم يوميا بشفط الوسط من خزانات مخرج القناة البولية قطريا بعيدا عن الميناء ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان.قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية بما يصل إلى ثلاثة ملليلتر من وسط تحريض الخلايا البودوسيتية كل يومين لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام ، استطلع الوسط من القناة البولية ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان. قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية يوميا بثلاثة ملليلتر من وسيط صيانة الخلايا البودوسيتية.وبالمثل ، قم بشفط الوسط من مخرج القناة الشعرية وقم بتجديد خزانات المدخل يوميا باستخدام وسيط الصيانة البطانية. باستخدام هذا البروتوكول ، تم استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان لتطوير نموذج وظيفي في المختبر للكبيبات عن طريق نشر الخلايا البطانية الوعائية والخلايا الوعائية. في اليوم 21 بعد تحريض الخلايا البودوسية وانتشار بطانة الأوعية الدموية ، عبرت الخلايا الموجودة داخل الرقائق عن علامات تحديد النسب مثل Podocin و Nephrine لخلايا podocytes و VE Cadherin و PECAM-1 للخلايا البطانية الوعائية.عبرت كل من طبقات الخلايا البطانية الوعائية والأوعية الدموية عن الكولاجين IV وهو بروتين GBM الأكثر وفرة في كبيبات الكلى. قامت رقائق الكبيبات بتصفية جزيئات صغيرة بشكل انتقائي مثل الأنسولين من الشعيرات الدموية إلى القناة البولية ، مع منع البروتينات الكبيرة مثل الألبومين من مغادرة القناة الشعرية ، مما يدل على وظيفة ترشيح جزيئي انتقائية. أثناء الحث البطاني في الأيام من الرابع إلى السابع ، قد تؤدي الزيادة في عدد الخلايا إلى طبقة ثانوية من الخلايا ولكن الإفراط في البذر قد يسبب تجميعا يمكن أن يعيق التمايز.يمكن ملاحظة تدفق سائل متقاطع غير متوقع بين القنوات البولية والشعيرات الدموية في حالة عدم كفاية الترابط بين مكونات شريحة PDMS ، أو انسداد في مسار تدفق السوائل ، أو حاجز ترشيح معرض. عند البذر البطاني والظهارة والحفاظ على الرقائق من الأيام 15 فصاعدا ، من المهم فحص فقاعات الهواء بصريا في القنوات في كل خطوة. في رقاقة الكبيبات متساوية المنشأ ، يمكن إعطاء الأدوية المرشحة ذات الصلة سريريا لاختبار إمكاناتها العلاجية أو مستويات السمية.تفتح هذه التقنية الآن فرصا لفهم الأساس الجيني لأمراض الكلى البشرية وتطوير علاجات شخصية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

توليد عضويات الأوعية الدموية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...